上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所王鸿利　　近年，随着基础理论和实验技术的不断发展，血栓与止血的检验方法及其临床应用也有很大的进展，下面就近年来血栓与止血检验的进展作一简述。（一）血小板微颗粒检测血小板被激活后，它以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成血小板颗粒（platelet micropaticle, PMP ）。PMP 的体积较正常血小板为小，但有完整的血小板膜结构和功能。检测血循环中的PMP 可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。检测方法：流式细胞术或微颗粒捕获法。参考值：58±15/104PLT （山东大学齐鲁医院）（一）血小板微颗粒检测临床意义：PMP 主要反映血小板活化或破坏，用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。1. 急性冠脉综合征（ACS ）PMP↑2. 脑血栓形成PMP↑3.ITP 出血的判断指标4.PNH 患者PMP↑5. 肿瘤患者PMP↑（二）血小板-白细胞聚集体检测血小板被激活后，血小板释放P- 选择素（P-selectin 或GMP-140 ）。P- 选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的P- 选择素配体糖蛋白-1 （PSLG-1 ）结合形成血小板-白细胞聚集物和（或）血小板-单核细胞聚集物，是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。检测方法：流式细胞术。参考值：15.3±8.5 ％（PLA/L ）瑞典报道。临床意义：动物实验和临床研究表明，血小板-白细胞聚集物是更敏感和更特异的血栓标志物。在胸痛患者中，血小板-白细胞聚集体水平为AMI 胸痛组＞非AMI 胸痛组＞正常对照组；分别为34.2±10.3 ％＞19.3±1.4 ％＞15.3±8.5 ％（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（vonWillebrand factor ，vWF ）主要受vWF 裂解蛋白酶（vWF cleaving proteinase,vWF-CP ）的调节。使vWF 不能过度地参与血小板的黏附和聚集。因此vWF-CP 是限制血栓形成的指标之一。（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测检测方法：ELISA 法。参考值：83 例正常人（1）血浆（n＝30 ）vWF ：CBA 为2.1 ％～40.5 ％（21.9±9.2 ％）（2）血清（n＝53 ）vWF ：CBA 为2.4 ％～52.0 ％（20.5±10.8 ％）临床意义：1. 血栓性血小板减少性紫癜-溶血性尿毒症综合征（TTP-HUS ）：vWF-CP 基因缺陷或存在抗vWF －CP 自身抗体,故vWF-CP↓, 使超大vWF 不能降解，导致血栓形成。其特异性97 ％，敏感性100 ％。2. 血管性血友病（vWD ）：血浆vWF-CBA 水平明显低于正常。3. 恶性肿瘤：vWF-CP 活性水平显著低于正常（四）双相APTT （biphasic APTT ）检测凝血是一个动态变化的过程，而传统的APTT 检测只能提供血液凝固时间这一单个的信息。双相APTT 检测，是在常规APTT 检测的基础上，联合利用光度计和分析软件，全程记录血浆凝固前后浊度的变化，并且绘制血液凝固过程中的透光度的波形变化图，可以提供在纤维蛋白聚集体形成之前凝血时间、速率、加速度的变化的多种量化的信息。（四）双相APTT （biphasic APTT ）检测检测方法：法国生物梅里埃（bioMerieux ）公司的MDA 血凝分析仪。（四）双相APTT （biphasic APTT ）检测临床意义：对诊断pre-DIC 特别有价值。敏感性为97.6 ％，特异性为98 ％。大于50 ％的患者在DIC 前18h 就出现双相APTT 的变化。（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测　凝血酶激活的纤溶抑制物（thrombin activatable fibrinolysis inhibitor ，TAFI ）由肝脏合成，经凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM ）作用后变成活化型的TAFIα。TAFIα具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是TAFI 也受蛋白C抑制物（PCI ）的抑制。（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测检测方法：TAFI: Ag ELISA 法TAFI: A  发色底物法参考值：（上海瑞金医院）TAFI: Ag （n＝34 ）为77±28 ％（21 ％～133 ％）；TAFI: A （n＝34 ）为24±5mg/L （14 ～34μg/L ）。临床意义：TAFI: Ag 和TAFI: A 水平升高：见于深静脉血栓（DVT ）、动脉血栓（冠心病）、微血栓（DIC ），其他TAFI 水平升高还见于感染、炎症、FV Leiden 突变。TAFI 水平降低：见于某些凝血因子减少（如血友病、FXI 减低），急性早幼粒细胞白血病（TAFI: A 减低66 ％，TAFI: Ag 正常）。（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C 受体检测（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C 受体检测检测方法：双抗体夹心ELISA 法。参考值：血浆sEPCR 为115.2±20.7μg/L 。临床意义：血浆sEPCR 水平的增高是反映血管损伤和抗APC 抗凝作用的特异性标志物。安徽省立医院的结果见下表。（七）蛋白C Global 试验凝血酶（T）与血管内皮细胞表面的凝血酶调节蛋白（TM ）形成复合物（T-TM ），后者使蛋白C（PC ）形成活化蛋白C（APC ）。APC 在蛋白S（PS ）的辅助下，灭活因子Va 和因子VIIIa ，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1 （PAI-1 ）使纤溶活性增强。此外，Agkistrodon contorix 蛇毒可以取代T-TM 复合物直接激活PC ，使PC 转化为APC ，APC 也受PCI 的抑制。（七）蛋白C Global 试验检测方法：在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC 转变为APC 。随后加入APTT 试剂以检测依赖PC 活性的血浆凝固时间（Protein C activity-dependent clotting time ，PCAT ）。若待测血浆中的PC 系统正常，则加入Ca2+ 后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在试验过程中以缓冲液代替PC 激活剂，血浆不依赖PC 活性的血浆凝固时间（PCAT/O ），其结果应短于60 秒。参考值：PCAT 为85 ～200 秒，PCAT/O 为33 ～55 秒（n＝234 ）临床意义：本试验多用于蛋白C、蛋白S、FV Leiden 突变和FII 20210 G→A 突变的检测，起到蛋白C系统筛选检测作用。本试验也有假阳性，见于凝血因子V、VIII 活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物等。（八）蛋白Z抗原检测蛋白Z（protein Z ，PZ ）是二十世纪90 年代发现的一种血液凝固调节蛋白，为一种维生素K依赖的单链糖蛋白，由肝脏合成后分泌入血。在Ca2+ 和磷脂存在时，PZ 可与蛋白Z 依赖的凝血酶抑制物（protein Z-dependent protase inhibitor ，ZPI ）结合，并进一步与FXa 形成Xa-ZPI-PZ 复合物而使因子Xa 在一分钟内失去95 ％以上的凝血活性。（八）蛋白Z抗原检测检测方法：ELISA 法参考值：法国学者报道为1.04 ～3.57mg/L 。临床意义：目前PZ 在临床上的意义尚不十分明了。Wasse 等研究发现PZ 缺乏（＜1.0 mg/L ）在缺血性脑卒中和健康对照中分别为20 ％和5 ％，二者具有显著性差异，PZ 缺乏可使缺血性脑卒中的危险性提高4 倍。Sofi 等报道在急性冠脉综合征病人当中PZ 水平明显低于健康对照，说明PZ 缺乏是导致急性冠脉综合征的独立的危险因素。（九）谷氨酸型纤溶酶（原）检测（Glu- Pln 或Glu-Plg ）在微量纤溶酶（Pln ）作用下，纤溶酶原（Plg ）NH2 端的精（68 ）-蛋（69 ）及赖（77 ）-赖（78 ）-缬（79 ）被裂解，生成谷氨酸型纤溶酶原（Glu-Plg 或Glu- Pln ）和赖氨酸型纤溶酶原（Lys-Plg 或Lys-Pln ）。Glu-Plg 约占90 ％，Lys-Plg 仅占10 ％。（九）谷氨酸型纤溶酶（原）检测（Glu- Pln 或Glu-Plg ）检测方法：人血浆Glu-Plg （Glu-Pln ）用双抗体夹心ELISA 法检测。抗Glu-Plg （NH2 端1～65aa ）抗原表位的单抗（LW5G5 ）作为包被抗体，抗Plg （Pln ）重链区单抗（LW10F7 ）作为酶标记抗体，二者构建人血浆Glu-Plg （Pln ）双抗体夹心ELISA 检测方法。参考值：213.9±45.8mg/L （n=220 ，上海第二医科大学，医学检验重点实验室）。（九）谷氨酸型纤溶酶（原）检测（Glu- Pln 或Glu-Plg ）临床意义：Glu-Plg （Pln ）水平降低，反映纤溶酶原激活物（t-PA 、u-PA ）活性增强。见于原发性纤溶，重症肝病、肝硬化、肝叶切除术、门脉高压、肝移植、大型手术，前置胎盘、胎盘早剥、死胎滞留、妊高征、羊水栓塞，恶性肿瘤播散、严重感染，以及各种原因所致DIC 等。（十）流式细胞术在血栓与止血检验中的应用（一）检测血小板功能缺陷症1. 血小板计数(Plt)  尤其对Plt 低的患者特别有用，误差<5% 。2. 原发性血小板减少性紫癜(ITP) 对ITP ，血小板表面免疫球蛋白(pAIg) 增加，血小板颗粒(PMPS) 增加，网织血小板增多。3. 血小板无力症血小板Gp IIb/IIIa 减少, GP IIb/IIIa 与纤维蛋白原(Fg) 结合能力减低。4. 巨大血小板综合征血小板Gp Ib/IX 表达减少。5. 血管性血友病(vWD)  利用抗vWF 单抗可以检测vWF 与GPIb 的结合能力减低（十）流式细胞术在血栓与止血检验中的应用（二）检测血栓性疾病可以反映血小板激活的程度。血小板激活时，抗GP IIb/IIIa 、抗P- 选择素(GM-140) 、抗53FD 溶酶体和抗110 000 溶酶体等单抗，在血小板膜上表达增多，但抗GP Ib/IX 结合力减低。血小板P- 选择素与纤维蛋白原结合能力增加。（十一）抗体芯片技术抗体芯片（Antibody Microarray ），是蛋白芯片的一种，是将能识别特异抗原的抗体制成微阵列，检测生物样品中抗原蛋白表达模式的方法。这种抗体微阵列可以在一次简单实验中同时检测样品中的数百甚至数千种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。 （十一）抗体芯片技术抗体芯片技术在血栓与止血检验领域有着很好的应用前景。目前正在研发过程中的出凝血疾病诊断抗体芯片，是将针对各种凝血因子和抗凝血因子的单克隆抗体分别固定在合适的片基上，来检测血清标本中各种凝血因子和抗凝血因子的抗原，从而可以迅速诊断遗传性易栓症和出血性疾病。（十二）植入前单细胞基因诊断植入前诊断（preimplantation genetic diagnosis ，PGD ）是辅助生殖技术与遗传学技术相结合的一种孕前诊断技术。基本思路：体外受精后发育至6～8细胞期的胚胎在显微操作下活检1～2个单卵裂球细胞进行基因或染色体分析，选择正常胚胎植入宫内，从而获得健康胎儿。（十二）植入前单细胞基因诊断PGD 优点：避免了早期或中期妊娠后再行产前诊断孕妇所面临可能流产带来的巨大身心创伤；避免了关于流产的伦理学争议；避免了绒毛取样、羊膜腔穿刺、脐带穿刺带来的出血、流产、宫内感染等并发症。（十二）植入前单细胞基因诊断基因分析是PGD 中难度最大的部分：标本量少，要求在48 小时内对标本做出诊断，并对诊断策略的灵敏性和特异性有很高的要求。目前针对单基因疾病的检测常用PCR 技术；巢式PCR 、荧光PCR 、荧光定量PCR 、多重PCR 、全基因组扩增。针对染色体异常的检测常用FISH 技术。* * （一）血小板微颗粒检测（二）血小板-白细胞聚集体检测vWF-CP 为金属蛋白酶ADAMTS 亚家族中的一个成员（ADAMTS-13 ）（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测双相APTT 透射波形图(A: 正常; B: DIC)  （五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测（五）凝血酶激活的纤溶抑制物检测可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（soluble endothelial protein C receptor, sEPCR ）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连EPCR ，一部分游离于血浆称sEPCR 。血浆中sEPCR 与膜连的EPCR 具有相反的作用。sEPCR 可与PC 和APC 结合，抑制PC 的活化和抑制APC 的抗凝活性，减轻膜连EPCR 的增强PC 活化和APC 的抗凝作用，所以血浆sEPCR 水平的增高是反映血管损伤和抗APC 抗凝作用的特异性标志物。（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C 受体检测（七）蛋白C Global 试验（七）蛋白C Global 试验