血栓与止血检测进展王鸿利上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海血液学研究所，200025 近年，随着基础理论和实验技术的发展，血栓和止血检验及其临床应用也有了很大的进展，本文就此作一简述。（一）血小板微颗粒检测血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成直径为0.1 ～1.0μm 的血小板颗粒（Platelet Microparticle,PMP) 。PMP 的体积较正常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。PMP 膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP ）Ⅱb/Ⅲa （GP Ⅱb/Ⅲa ）、GPⅠb/Ⅸ-Ⅴ、血小板活化因子（PAF ）、β- 样前体淀粉蛋白、Ca2+ 依赖性蛋白酶Calpainyi 以及有促凝作用的磷脂等。因此检测血循环中的PMP 可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。〔检测方法〕流式细胞术。主要试剂为CD61 parcp: 多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗血小板GPⅢa 的单克隆抗体〔参考值〕66±17 个/104 血小板（山东大学齐鲁医院报道）。〔临床意义〕PMP 主要用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。1. 急性冠脉综合征（ACS ）：有证据显示，PMP 参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程。Cawaz 等对急性心肌梗死（AMI ）施行PTCA 患者进行系列血小板功能研究，发现PTCA 术后患者的血小板数因消耗增加而减少，PMP 因大量形成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。Katopodis 等对行冠脉血栓形成术的ACS 患者进行观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期发生AMI 、不稳定性心绞痛者），结果发现，试验组患者PMP 水平较正常对照组明显增高。2. 脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者进行PMP 检测。结果发现，阿尔茨海默病患者的PMP 水平与正常对照组无统计学差异，而其他疾病组患者的PMP 水平均显著高于正常对照组，且治疗后有明显的降低，而且小血管血栓组患者的PMP 水平高于大血管血栓组患者。表明PMP 水平的增高，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞。（二）血小板-白细胞聚集体检测血小板被激活后，血小板释放P- 选择素（P-selectin 或GMP-140 ）。P- 选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的P- 选择素配体糖蛋白-1 （PSLG-1 ）结合形成血小板-白细胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre - gate,PLA) 和（或）血小板-单核细胞聚集物（Platelet-Monocyte –Aggregate ）。该聚集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。〔检测方法〕流式细胞术。主要试剂为FTTC 标记的鼠抗人GPIb （CD42b ）单克隆抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45 单克隆抗体，FTTC 标记的鼠抗人P-selectin （CD62b ）单克隆抗体。〔参考值〕瑞典学者报道血小板-白细胞聚集物为15.3±8.5 ％（PLA/L ）。〔临床意义〕动物实验和临床研究表明，PLA 是更敏感和更特异的血栓标志物。一组93 例胸痛患者，其中9例为AMI 患者，其血小板-单核细胞聚集物为34.2±10.3 ％，84 例非AMI 胸痛患者的血小板-单核细胞聚集体为19.3±1.4 ％，二组差异显著（Ｐ＜0.05 ）；AMI 胸痛组和非AMI 胸痛组患者的血小板-单核细胞聚集物水平均较10 例正常对照组的血小板-单核细胞聚集物水平为高（Ｐ＜0.001 ）。（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF ）主要受vWF 裂解蛋白酶（vWF C-leaving Proteinase, vWF -CP ）的调节。vWF –CP 作用于vWF 分子量为250000 多聚体的Try （842 ）-Met （843 ）之间的肽键，将它们水解成分子量为176000 和140000 的两个小分子肽段。此时vWF 不能过度地参与血小板的粘附和聚集，因此vWF –CP 是限制血栓形成的标志物之一。〔检测方法〕ELISA 。以Ⅲ型胶原包被酶标板，2.5 ％BSA 封闭，分别加入未透析的标本和经Slide-A-Lyzer 透析过的标本，一抗为兔抗人vWF 多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG ，加入底物OPD490nm 显色。结果以透析前后的OPD490 比值作为该份标本的残余胶原结合活性（vWF:CBA 或R- CBA ）表示，R- CBA 越高，vWF-CP 活性越低。〔参考值〕83 例正常人①血浆（n﹦30 ）vWF:CBA 范围为2.1 ％～40.5 ％（21.9±9.2 ％）；②血清（n﹦53 ）vWF:CBA 范围为2.4 ％～52.0 ％（20.5±10.8 ％）（苏州大学附一院）。〔临床意义〕1. 血栓性血小板减少性紫癜（TTP ）：由于患者的vWF-CP 基因缺陷或患者血浆中存在抗vWF-CP 自身抗体，使vWF-CP 血浆水平显著降低，不能正常裂解超大分子量的vWF 多聚体（UL- vWF ）。体内聚集的UL- vWF 易于血小板结合，促使血小板粘附和聚集，引起TTP 病理过程的发生和发展。一组5例TTP 患者检测vWF:CBA 结果为48.1 ％～96.5 ％（78.2±20.2 ％），较正常对照组明显增高，反映患者vWF-CP 明显降低。2. 血管性血友病（vWD ）：据报道，21 例vWF 患者血浆vWF:CBA 水平明显降于30 例正常人、15 例血友病患者及30 例其他出血性疾病患者（Ｐ＜0.001 ）。在vWF 中，Ⅰ型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA 比值≈1.0 ；Ⅱ型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA 比值＞2.0 ；Ⅲ型患者的vWF:Ag/ vWF:CBA 都极低，其vWF:Ag/ vWF:CBA 比值具有可变性。3. 恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP 活性水平显著低于正常人，伴有远处转移患者的vWF-CP 活性水平更低，接受手术治疗后患者的vWF-CP 可升高，导致血浆大分子多聚体增多，促使vWF 参与血小板粘附和聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和血栓形成，反映vWF 是参与恶性肿瘤血栓形成机制之一。(四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测（monoclonal antibody specific immobili- zation of platelet antigen,MAIPA ）将待测抗体、单抗和血小板共同温育，得到血小板膜GP 、待测标本和单抗三分子复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色被抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测抗体水平呈正比。〔参考值〕抗GP Ⅱb/Ⅲa 阳性，A值＞0.133 ；抗GPⅠb 阳性，A 值＞0.209 〔临床意义〕检测血小板相关抗体，其敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA 法。用于检测ITP 和同种免疫血小板减少症。两种方法对ITP 诊断的比较( 五)凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI ）检测凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM ）将由肝脏合成的、分子量为55KD 的凝血酶激活的纤溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI ）的Arg （92 ）-Ala （93 ）之间的肽键水解后，脱去一个活化肽，TAFI 变成活化型的TAFI a 。TAFI 具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是TAFI 也受蛋白C抑制物（PCI ）的抑制。〔检测方法〕采用ELISA 测定TAFI ：Ag 。以鼠抗人TAFI 单克隆抗体包被酶标板，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗人TAFI 抗体，充分作用后加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本TAFI 的含量成正比。TAFI:A 采用发色底物法测定。〔参考值〕TAFI:Ag （n﹦34 ）为77 ％±28 ％（21 ～133 ％）；TAFI:A （n﹦34 ）为24 ±5μg/L （14 ～34μg/L ）（上海瑞金医院）〔临床意义〕1. 深静脉血栓（DVT ）：Tiburg 等对脑74 例初发DVT 患者的TAFI:Ag 进行检测，发现其水平增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI ：Ag 水平超过90 ％，其水平的危险性水平2倍，此时患者的纤溶活性减低。2. 动脉血栓（冠心病）：瑞金医院对19 例冠心病患者检测了TAFI:Ag 和TAFI:A ，发现冠心病患者的TAFI:Ag 和TAFI:A 的水平均高于正常对照组（Ｐ＜0.001 ），与Silveira 报道11 例冠心病的检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。此外，TAFI 水平增高也见于不稳定性心绞痛。3. 微血栓（DIC ）：瑞金医院对15 例DIC 患者检测了TAFI:Ag 和TAFI:A ，发现患者的水平明显低于正常对照组（Ｐ＜0.001 ），表明患者纤溶活性明显升高。4. 其他：TAFI 水平升高还见于感染、因子V Leiden 突变；TAFI 水平减低还见于某些凝血因子缺乏（血友病、FⅪ缺乏症）、急性早幼粒细胞白血病（TAFI:A 减低66 ％，但TAFI:Ag 正常）。（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（Soluble Endothelial Protein C Receptoe,sEPCR ）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连EPCR ，一部分流离于血浆称sEPCR 。克隆的膜连EPCR cDNA 全长1.3kb, 是一种由221 个氨基酸组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR 通过促进T-TM 复合物与蛋白C（PC ）的结合，进而放大PC 的活性；此外，EPCR 还对体内急性炎症反应河DIC 的发生具有保护作用。然而，血浆中sEPCR 与膜连的EPCR 具有相反的作用。sEPCR 也可与PC 和活化蛋白C（APC ）结合。抑制PC 的活化和抑制APC 的抗凝活性，减轻膜连EPCR 的增强PC 活化和APC 的抗凝作用，所以血浆sEPCR 水平的增高市反映血管损伤和抗APC 抗凝作用的特异性标志物。〔检测方法〕采用ELISA 。以单克隆-抗包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀释度的sEPCR 标准品后，以生物素标记的单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显色，绘制标准曲线。〔参考值〕血浆sEPCR 为115.2±20.7μg/L 〔临床意义〕安徽省立医院报道的结果见表1 （七）蛋白C Global 试验凝血酶（T）与血管内皮细胞的凝血酶调节蛋白（TM ）形成复合物（T-TM ），后者使PC 转化为APC 。APC 在蛋白S（PS ）的辅助下，灭活因子Va 和因子Ⅷa ，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1 （PAI-1 ），使纤溶活性增强。然而，Agkistrodon contorix 蛇毒可以取代T-TM 复合物直接激活PC ，使PC 转化为APC ，APC 也受PAI 的抑制。〔检测方法〕在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC ，使PC 转化为AP- C 。随后在检测系统中加入APTT 试剂以检测依赖PC 活性的血浆凝固时间（Protein C Activ-Ity Dependent ClottingTime,PCAT ）若待测血浆中的PC 系统正常，则加入Ca2+ 后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在实验过程中以缓冲液代替PC 激活剂，血浆不依赖PC 活性的血浆凝固时（PCAT/O ），其结果应短于60s 。〔参考值〕PCAT 为85 ～200s ，PCAT/O 为33 ～55s （n﹦234 ）。〔临床意义〕本试验对PC 活性低于参考值70 ％的检出率为90 ％；对PS 活性低于参考值的60 ％的检出率为89 ％；对凝血因子ⅤLeiden 突变的检出率为100 ％；对凝血酶原（FⅡ）20210 C→A 突变的检出率为84 ％。本试验的检出特异性为79 ％。因此，本试验多用于PC 、PS 、FⅤLeiden 突变和FⅡ20210 C→A 突