药品质量控制中的现代分析方法与技术Modern analytical methods & techniques in quality control of drugs Capillary electrophoresis,CE UPLC UltraPerformance LC (UPLC ) technology starts with unique 1.7 μm small-particle chemistries. Chromatographers no longer need to choose between speed and resolution—with UPLC you get both. Mass spectroscopy MSNuclear magnetic resonance spectrometry NMRX-ray diffraction methodNear infrared spectrometry NIRS Full-Scan MS of Buspirone Single Ion Monitoring (SIM) Product Ion Spectrum of Buspirone Precursor Ion Scan Mode for Buspirone Metabolites Neutral Loss Scan of Buspirone Metabolites 2.3 药物分析中的典型应用Chlroamphenicol( 氯霉素，CAP) 残留测定黄杨生物碱成分鉴定苯甲酸利扎曲普坦人体药代动力学研究CAP SRM Result: CAP Standard Q1 peak width = 0.7 Da CAP SRM Result: Kidney Blank CAP SRM Result: Kidney Spiked (0.5ng/g) CAP H-SRM Result: CAP Standard Q1 peak width = 0.2 Da CAP H-SRM Result: Kidney Blank CAP H-SRM Result: Kidney Spiked (0.5ng/g) www.book118.com 黄杨宁生物碱HPLC-MS 联用鉴定黄杨科植物小叶黄杨Buxus microphlla Sieb. et. Zucc. var. sinica Rehd.et Wils 中含有具有较强心血管疾病治疗活性的孕甾烷生物碱，主要含环维黄杨星D、环黄杨碱D 和环常绿黄杨碱C 等生物碱成分。环维黄杨星D及其有关生物碱的鉴别质谱条件电喷雾离子化正离子检测喷口电压5000V 雾化气压35psi 辅助气压力5psi 毛细管温度350℃碰撞气氩气压力1.5mTorr 色谱条件色谱柱：Lichrospher SiO2 (250mm×4.6mm,5 μm) 流动相：四氢呋喃-甲醇-乙腈-氨水( 32:50:13:3) 流速：1mL·min -1 柱温：30℃药理作用刺激大脑血管壁的后接点5-HT1B 受体收缩血管，降低颅内血管通透性；刺激三叉神经前突触5-HT1D 受体，调节神经递质的释放，抑制硬膜的神经原性炎症反应和血浆外渗；阻止血管肽的释放，使血管口径正常化，通过收缩颅内血管并抑制神经炎症；刺激脑干5-HT1B 或5-HT1D 受体，抑制三叉神经核兴奋；减少颈动脉血流；透过血脑屏障，增加脑血流量。实验内容建立苯甲酸利扎曲普坦在血浆、尿样浓度的LC-MS/MS 测定方法苯甲酸利扎曲普坦分散片和胶囊进行生物等效性试验苯甲酸利扎曲普坦片体内药代动力学研究单剂量(5,10,15 mg) 多次给药(10 mg) 稳态(10 mg) LC-MS/MS 测定方法建立测定方法选择质谱条件优化色谱条件选择色谱柱选择缓冲盐选择血浆处理方法液液萃取法蛋白沉淀法内标选择质谱条件血浆处理方法内标选择单次给药受试者单次口服苯甲酸利扎曲普坦片后，苯甲酸利扎曲普坦的Cmax 和AUC 与服药剂量成正比关系。数据分析创新意识LC-MS/MS m/z 270 m/z 158 Phenomenx PFP 1% 冰醋酸, 0.2% 醋酸铵蛋白沉淀法盐酸曲马多色谱条件流动相A：醋酸盐缓冲液(1% 冰醋酸，2% 醋酸铵;pH 3.5) 流动相B：甲醇(0.1% 甲酸) 梯度条件过程：0 min (B50%)→1.0 min (B95%)→4.5 min (B95%)→4.6 min (B50%) →6.5 min (B50%) 空白溶剂色谱图预处理的空白血浆色谱图离子检测方式：ESI+ SRM 检测对象：利扎曲普坦m/z 269.9→158.1 曲马多m/z 263.9→58.0 喷口电压：5000 V 雾化气压：35 psi 辅助气压力：5 psi 毛细管温度：350℃碰撞气氩气压力：1.3mTorr 碰撞能量：20 eV 质谱条件优化利扎曲普坦LC-MS 质谱扫描图（m/z =270 ）利扎曲普坦LC-MS/MS 质谱扫描图（m/z=158 ）利扎曲普坦质谱裂解图m/z 270 m/z 158 （碰撞能量：20ev ）色谱条件选择色谱柱Intersil-ODS C18 Lichrospher-C18 Zorbak-ODS C18 Lichrospher-CN P henomenx Curosil-PFP 缓冲盐条件(0.1%HCOOH,v/v; 0.2% 醋酸铵,w/v; pH3.0 ）采用PFP （五氟苯基）柱，样品的保留适当，峰型良好，有机相和水相的比例也较为适当。醋酸铵(w/v) 0.05% 0.1% 0.2% 甲醇:水=(50:50) 0.2% (w/v) 醋酸铵样品峰响应高，拖尾得到一定程度的改善。0.1% HCOOH 0.1% HAC 0.2% HAC 0.5% HAC 1.0% HAC 1%HAC 水相pH 值为3.5 ，样品保留时间合适，峰形良好。苯甲酸利扎曲普坦血浆提取条件试验佐米曲普坦(Zolmitriptan) MW ：287 分子式：C16H21N3O2 盐酸曲马多(Tramadol hydrochloric) MW ：299.8 分子式：C16H25NO2 曲马多LC-MS 质谱扫描图（m/z=264 ）曲马多LC-MS/MS 质谱扫描图（m/z=58 ）曲马多质谱裂解图m/z 264 m/z 58 Cmax －Dose AUC －Dose TIC 321->152 321->194 321->257 CAP Peak Area Counts = 2.4E4 TIC 321->152 321->194 321->257 TIC 321->152 321->194 321->257 CAP Not accurate for confirmation CAP detected TIC 321->152 321->194 321->257 Peak Area Counts = 7.3E3 TIC 321->152 321->194 321->257 No CAP detected TIC 321->152 321->194 321->257 CAP 黄杨生物碱HPLC-ELSD 色谱图色谱条件色谱柱：Lichrospher SiO2 (250mm×4.6mm,5 μm) 流动相：四氢呋喃-甲醇-乙腈-氨水( 32:50:13:3) 流速：1mL·min -1 柱温：30℃ELSD 参数：漂移管温度70℃雾化气体（N2 ）流速：1.5 L·min -1 环维黄杨星D和有关生物碱含量测定结果2.8 4.63 4.62 3.38 3.65 1.07 RSD% 13.99 0.93 0.80 8.65 3.61 85.89 Mean 14.53 0.97 0.79 9.03 3.74 84.84 6 13.75 0.85 0.74 8.64 3.52 85.05 5 14.10 0.93 0.87 8.76 3.54 85.70 4 14.03 0.95 0.81 8.82 3.46 85.83 3 14.15 0.98 0.80 8.54 3.84 87.08 2 13.37 0.92 0.79 8.09 3.57 86.85 1 有关生物碱总含量% 峰5生物碱含量% 峰4生物碱含量% 峰2生物碱含量% 峰1生物碱含量% 环维黄杨星D含量% 次数黄杨宁LC-MS/MS 全扫描色谱图黄杨宁LC-MS/MS 全扫描色谱放大图1 2 3 4 5 6 7 8 9 峰1母离子质荷比峰1二级质谱图[M+H]+=370 可能为峰1的黄杨宁有关生物碱Cyclobuxomicreine K Cyclobuxosuffrine K Buxenone M Cyclobuxoviridine B 峰2母离子质荷比峰2二级质谱图[M+H]+= 431 可能为峰2的黄杨宁有关生物碱Cyclomicrophylline B Buxazidine B Cyclobuxoxazine C Cyclomicrophylline C 峰3母离子质荷比峰3二级质谱图[M+H]+= 415 可能为峰3的黄杨宁有关生物碱Cycloprotobuxine A Cyclokreanine B Cyclovirobuxeine B 16-deoxybuxidienine C 峰4母离子质荷比峰4二级质谱图环常绿黄杨碱C [M+H]+= 417 峰5母离子质荷比峰5二级质谱图[M+H]+= 401 383.34 可能为峰5的黄杨宁有关生物碱Cycloprotobuxine C Buxaminol E Buxocyclamine A Cyclobuxine B 峰6母离子质荷比峰6二级质谱图环黄杨碱D [M+H]+= 387 峰7母离子质荷比峰7二级质谱图环维黄杨星D [M+H]+= 403 峰8母离子质荷比[M+H]+= 375 357.15 峰8二级质谱图峰9二级质谱图371.17 m/z=375 m/z=357 m/z=344 m/z=326 m/z=309 357.15 峰9母离子质荷比[M+H]+= 389 峰9二级质谱图371.17 m/z=389 m/z=371 m/z=358 m/z=340 m/z=309 371.17 9.77 8.28 7.63 7.03 6.11 5.92 5.35 4.03 3.92 tR (min) 可能为Cyclobuxine D 双键加氢还原产物371，358，340，173，70，58 389 9 未有相关文献报道357，344，326，309，58 375 8 Cyclovirobuxine D 385，372，354，70，58 403 7 Cyclobuxine D 369，356，338，171，58 387 6 Cycloprotobuxine C, Buxaminol E, Buxocyclamine A, Cyclobuxine B 370，352，326，171，58 401 5 Cylcyclovirobuxine C 399，386，368，84，58 417 4 Cycloprotobuxine A,Cyclokreanine B, Cyclovirobuxeine B, 16-deoxybuxidienine C 384，84，58 415 3 Buxazidine B, Cyclomicrophylline B, Cyclobuxoxazine C, Cyclomicrophylline C 413，382，323，86，70，58 431 2 Cyclobuxomicreine K, Cyclobuxosuffrine K, Buxenone M, Cyclobuxoviridine B 339，325，283，135，70，58 370 1 可能生物碱名称特征碎片离子( m/z) [ M+H]+ (m/z) 峰位号HPLC-ELSD 法黄杨宁有关生物碱归属表苯甲酸利扎曲普坦(Rizatriptan Benzoate) MW: 391.47 分子式：C15H19O5·C7H6O2 5-HT 受体拮抗剂www.book118.com 苯甲酸利扎曲普坦人体药代动力学研究* 第十六章现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而有效的手段与动力。 色谱及其联用技术：药学研究－－分子水平。手性分析：毛细管电泳及手性色谱技术－－药物研究与质量控制提供了保障。现代光谱技术：药物结构鉴定，微量杂质检定。第一节概况Modern chromatogr & its application 药物现代色谱法及其应用现代光谱法及其应用M odern spectroscopy & its application in pharmaceutical analysis GC-FTIR GC-MS UPLC-MS HPLC-NMR Hyphenated Techniques in Chromatography 现代联用技术及其应用HPLC-MS CE-MS + + 样品与溶剂脱离及电离EI ESI APCI LC/MS 接口离子源质量分析器检测离子HPLC 数据系统质谱离子识别Quadrapole Time of Flight Fourier Transform …+ + + + + + + 离子检测+ + - + + + + + + - + + + 第二节液质联用技术与应用2.1 离子化方式2.2 离子分离与测定模式Full-Scan Mass Spectrometry Advantage Provides MW Information Buspirone ( 丁螺环酮) C21H31N5O2 MW = 385 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 25 50 75 100 Relative Abundance 386 408 (M+H)+ (M+Na)+ Advantages Targeted Analyte Monitoring High Duty Cycle Simple Disadvantages Can suffer from interferences Not as sensitive or selective as SRM (see below) Fixed m/z Pass All Pass All Product Ion Scanning: A Tandem MS Method Advantage Provides Structural Information Disadvantage Low duty cycle Fixed m/z Pass All Scanning Product Ion Spectrum Q3 Q2 Q1 100 150 200 250 300 350 400 m/z 25 50 75 100 Relative Abundance 122 386 222 150 265 180 (M+H)+ Precursor Ion Scanning Advantage ID compounds producing specific fragment ion (e.g., PO3 for phosphopeptides) Disadvantage Low duty cycle Fixed m/z Pass All Scanning Precursor Ion Spectrum Q3 Q2 Q1 Precursor Ion Scan: Q3 set to m/z 122 100 200 300 400 500 m/z Relative Abundance 402 386 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 25 50 75 100 Relative Abundance 11.62 13.8