2010 年版中国药典微生物检验主要增修订内容浙江省食品药品检验所王知坚增修订背景药品微生物限度检查、无菌检查各论标准化的研究药品微生物限度检查用培养基灵敏度检查方法的研究中国药典与国外药典细菌计数方法的比较离心集菌法标准化的研究贴膏剂微生物限度检查法的研究大肠菌群检查用培养基的比较白色念珠菌检查法的研究防腐剂效力测定方法的研究药品微生物检验替代方法验证的方法研究浙江所承担的主要工作科研工作药品微生物检验替代方法验证的方法研究药品微生物限度检查、无菌检查各论标准化的研究药品微生物限度检查用培养基灵敏度检查方法的研究中国药典与国外药典细菌计数方法的比较大肠菌群检查用培养基的比较附录增修订工作药品微生物检验替代方法验证指导原则主要成果药品微生物限度检查和无菌检查的各论标准化修订了无菌检查法增修订了微生物限度检查法修订了一个指导原则－灭菌法新增了四个指导原则抑菌剂效力检查法指导原则药品微生物实验室规范指导原则微生物限度检查法应用指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则各论标准化微生物限度检查各论富马酸酮替芬滴鼻液【微生物限度】取本品10ml ，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10 的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数：取供试液，采用培养基稀释法（0.2ml/ 皿），依法检查（附录XI J ），应符合规定。控制菌：取规定量供试液，依法检查（附录XI J ），应符合规定。各论标准化聚维酮碘溶液【微生物限度】取本品10ml ，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10 的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数：取供试液，用平皿法测定菌数，浇注含4％硫代硫酸钠（W/V ）的计数用培养基，依法检查（附录XI J ），应符合规定。控制菌：取规定量供试液，接种至含4％硫代硫酸钠（W/V ）的增菌培养基中，依法检查（附录XI J ），应符合规定。各论标准化无菌检查各论亚叶酸钙注射液【无菌】取本品，采用薄膜过滤法处理，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H ），应符合规定。注射用泮托拉唑钠【无菌】取本品，用0.9 ％无菌氯化钠溶液溶解，经薄膜过滤法处理，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H ），应符合规定。复方庚酸炔诺酮注射液【无菌】取本品，加含1％聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液稀释，经薄膜过滤法处理，用pH7.0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗（每膜不少于100ml ），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H ），应符合规定。各论标准化甲硝唑注射液【无菌】取本品，经薄膜过滤法处理，用pH7.0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液分次冲洗（每膜不少于500ml ），以生孢梭菌为阳性对照菌，依法检查（附录XI H ），应符合规定。注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠【无菌】取本品，加0.9% 无菌氯化钠溶液溶解并制成每1ml 中约含40mg 的溶液，经薄膜过滤法处理，用无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液分次冲洗（每膜不少于500ml ），以大肠埃希菌为阳性对照菌，依法检查（附录ⅪH ），应符合规定。无菌检查法前言部分培养基灵敏度检查稀释液、冲洗液等方法验证薄膜过滤法培养及观察结果判断表1、表2和表3 前言部分规定了防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出规定了日常检验还需要对环境进行监控对无菌检查的人员资质提出了要求培养基删除了硫乙醇酸盐流体培养基用于培养好氧菌、厌氧菌的规定删除了改良马丁培养基用于培养真菌的规定灵敏度检查修订了黑曲霉的孢子悬液制备方法，规定应使用含0.05 ％（v/v ）聚山梨酯80 的0.9 ％无菌氯化钠溶液稀释规定了稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限稀释液、冲洗液等规定可根据供试品的特性，选用其他经验证的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液方法验证标准菌种的选择上，删除了铜绿假单胞菌，增订了大肠埃希菌明确规定了薄膜过滤法验证时，应取每种培养基规定接种的供试品总量用于过滤薄膜过滤法增订了抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜的规定对每片滤膜的总冲洗量进行了规定，不得过1000ml 修订了无菌气（喷）雾剂供试品的检验方法，规定冰室的温度应至少为-20℃对装有药物的注射器供试品的检验方法进行了详细的规定培养及观察对于培养14 天后，不能从外观上判断有无微生物生长的情况，删除了可划线接种于斜面培养基上的规定，同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判断的规定结果判断增订了阳性对照管和阴性对照管的实验结果对于整体实验结果判断的作用表1、表2和表3 表1 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍表2 修订了表格名称，明确了该表格用于确定液体制剂的最少检验量修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍表3 修订了表格名称，明确了该表格用于确定固体制剂的最少检验量修订了注释项，对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍微生物限度检查法前言及检验量供试液制备计数实验的培养基适用性计数实验的方法验证计数实验的操作方法控制菌检查的培养基适用性控制菌检查的方法验证控制菌检查的内容标准体系前言及检验量前言中修订了控制菌检查的温度，规定与细菌计数实验温度相同，均为30 ～35℃前言中增订了对于特殊品种可以最小包装单位报告的规定检验量中对要求进行沙门菌检查的供试品，其检验量应增加20g 或20ml 的规定供试液制备增订了贴剂供试品的制备方法修订了离心沉淀法，删除了高速离心的规定，并对该方法的使用范围进行了限定计数实验的培养基适用性该部分内容均为新增规定了该内容的应用范围采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限引入了对照培养基的概念判定的依据：回收率大于70 ％，且形态一致计数实验的方法验证增订了常见干扰物的中和剂或灭活方法的参考表格对采用多种方法仍无法得到满意验证结果的情况，提供了两种办法允许使用更高稀释级的供试液进行方法验证实验，并以该稀释级供试液作为最低稀释级供试液进行供试品检验允许选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验计数实验的操作方法平皿法删除了应取2～3个连续适宜稀释级供试液进行检验的规定细菌培养时间延长为3天，霉菌、酵母菌培养时间延长为5天；规定必要时均可延长至7天菌数报告规则进行了修订：计数不再设置下限；以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告供试品中所含的菌数薄膜过滤法滤膜直径调整为约50mm ，并规定若采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整总冲洗量规定不得超过1000ml 控制菌检查的培养基适用性该部分内容均为新增规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目采用标准菌种比较的判定方法根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法在检查中引入了涂布接种的概念控制菌检查的方法验证删除了阴性菌对照组的概念控制菌检查的内容所有的生化试验均修订为鉴定试验大肠菌群的培养基进行了修订，现改用乳糖胆盐发酵培养基梭菌的增菌培养基修订为梭菌增菌培养基，删除了庖肉培养基增订了白色念珠菌检查法，并增订了与之相关的培养基标准体系菌落计数单位从“个”修订为“cfu”阴道、尿道给药制剂增订了白色念珠菌控制要求直肠给药制剂删除了大肠埃希菌的控制要求灭菌法前言湿热灭菌法过滤除菌法生物指示剂的制备前言修订了灭菌法的定义，强调灭菌法的作用是使被灭菌物品中残存微生物的概率下降至某一预期水平，从而突出了灭菌不是绝对的这一理念。修订了无菌保证水平的表述方式，强调其含义在于物品中活微生物的概率降低至某个可接受的水平。明确了对于最终灭菌物品而言，其微生物存活概率，即无菌保证水平不得高于百万分之一。在选择确定灭菌工艺时，增订了应考虑灭菌后物品的稳定性的规定。湿热灭菌法增订了选择湿热灭菌条件时应综合考虑的因素，如灭菌物品的热稳定性、热穿透力以及微生物污染程度等修订了F0 值的概念，突出了等效121℃标准灭菌时间的含义规定当选用F0 值概念进行灭菌程序控制时，除了对灭菌程序进行验证外，还必须在生产过程中对微生物进行监控，证明其数量低于设定的限度对热不稳定物品，强调应在生产全过程对产品中污染的微生物进行连续监控，并防止耐热菌的污染。规定这一类产品的F0 值一般不低于8min ，删除了“如产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F0 低于8”的规定。过滤除菌法对过滤器孔径的定义进行了说明，强调孔径与微生物的截留性能有关，而不是平均孔径的分布系数根据滤器孔径的定义，规定用于最终除菌的过滤器，必须选择除菌级过滤器，并应提供截留实验证明对过滤器的稳定性以及与被过滤液体的相容性进行了规定，明确过滤器使用者具有了解并评估这些性能的责任增订了滤膜完整性测试的标准，指出该测试标准应来自于相关细菌截留实验的数据规定了过滤操作的生产环境－无菌环境，将原标准中的“建议”修订为“应”生物指示剂的制备规定生物指示剂在制备完成后，应测定D值和孢子总数。抑菌剂效力检查法指导原则前言产品分类培养基测定方法前言规定了本指导原则的用途：测定抑菌剂活性，评价抑菌效力；指导制剂研发中抑菌剂的选择指出由于抑菌剂存在一定毒性，故制剂中抑菌剂的量应为最低有效剂量指出本指导原则用于包装未开启的成品制剂产品分类根据不同用途产品对微生物污染风险耐受程度的差异，将产品分成四类：1 类：注射剂、其他费肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2 类：局部给药制剂、非无菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂3 类：口服非固体制剂（非抗酸制剂）4 类：非固体抗酸制剂培养基培养基不同与微生物限度检查法，主要采用TSB 和TSA 用于细菌生长，沙氏葡萄糖肉汤和琼脂培养基用于真菌生长培养基适用性检查标准菌种与微生物限度检查略有不同，使用铜绿假单胞菌代替枯草芽孢杆菌测定方法菌种来源：除了培养基适用性检查中的菌种外，允许使用制剂中常见的污染微生物菌液制备：允许使用固体或液体培养基制备工作用菌种，并采用比浊法制备每1ml 中含108cfu 的菌悬液供试品接种：容器选择以供试品原包装容器为首