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Chapter7 细胞培养.ppt
运行环境:Win9X/Win2000/WinXP/Win2003/
医学语言:简体中文
医学类型:国产软件 - 医药 - 医学ppt
授权方式:共享版
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更新时间:2019-12-27 20:50:46
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Chapter7 细胞培养.ppt介绍

Chapter 7 细胞培养源起单细胞获得悬浮培养单细胞培养应用一、概述:1 、细胞培养:人工培养从植物或培养物上游离的细胞或小细胞团的实验方法。大量培养悬浮培养:生产个体培养单cell 培养:科研、改良★细胞密度:单位体积内的细胞数量,是影响细胞培养的关键技术环节。2、意义:1 )、单cell 全能性1965 Vasil 2 )、植物细胞生产(生物反应器):次生代谢产物,人工种子;3 )、遗传转化受体:单细胞、原生质体;4 )、筛选突变体:遗传改良;应用:药品、食品生产,科研etc. 二、单细胞或小细胞团的获得:1 )、机械分离:小规模实验及生产适用。2 )、酶解法:果胶酶分离单细胞纤维素酶破壁(必须对细胞进行渗透压保护,对某些种类不适用:eg 小麦、大麦、玉米etc. )3 )、由callus 获得:结构松散的callus 经振荡培养,可得到游离的细胞。★由组织培养物获得:获得均一、松散的(callus )适合悬浮培养的愈伤组织。培养基外植体高水平IAA ,2,4-D 取材原则:生活力强三、悬浮培养:将游离细胞或细胞团按一定密度,悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡培养,使培养细胞快速、大量增殖。分批培养1 、方法连续培养半连续培养例:分批培养:I 、建立callus :获得均一、松散callus ;II 、建立悬浮系:培养方法,(摇瓶培养)增殖规律;III 、悬浮系增殖:细胞批量增殖或获得次生产物1、生长曲线:S曲线2 、继代:①保持对数期;②缩短滞后期。☆滞后期长短:①细胞生长时期:对数期、直线期②细胞密度:1 万~10 万个/ml 悬浮系增殖的技术难点:通气、剪切力适应性;细胞同步化;①培养:培养基:BM+CYT/IAA ;培养条件:T,O2 ,PH ,r(转速)②同步化:理想悬浮系③细胞增殖的监测:适时测定细胞数量,掌握放罐时机。同步化处理方法:①饥饿法:进行分离必须营养物质限制②抑制法:化学试剂;eg 氨基脲嘧啶③低温处理④分级培养:流式细胞仪测定悬浮系细胞数量的方法:①细胞计数:血球计数板计数; ②干重,鲜重测定;③PVC 细胞密实体积; 取样离心测定固体物体积(水平转头)(ml/ml )④细胞活力测定:FDA 、依凡镁兰;相差显微镜镜检。2、培养基:与培养的细胞密度相关1 )、高密度悬浮系: >5X10 个/ml ①用B5 ,ER 等专用培养基;②对传统培养基作出改良能得到易散碎的callus 。eg :加大2,4-D 用量;改良MS ,加入VB ,CH 等天然复合物。2)、低密度悬浮系:< 5X10 个/ml ①条件培养基:用曾经培养过高密度系的培养液看护培养低密度细胞。i 、平板法、悬滴法低or 单cell 培养ii 、透析袋:P91 图6-2 ★群体效应???★低密度细胞培养系必须依赖于一些特殊微量物质的供应才能正常生长、增殖。②添加多种成分如:KM8P  43 种物质③密度极低or 单细胞培养用特殊方法:平板看护饲养层微室由此可见,细胞密度决定细胞分裂与否:①细胞分裂要求细胞密度达到一定水平;②细胞分裂中会产生某些物质,并分泌到培养基中,只有当这些物质在培养基中达到一定的临界水平,cell 分裂才能启动。细胞密度保证细胞密度单细胞培养困难条件培养基(加高密度系培养液)促分裂化合物含多种物质的培养基(生长因子)(eg :KM8P )四、单细胞培养:1 、培养方法:1 )、平板法:薄层培养①方法:P96 图6-3  ②原理:保证细胞密度;通常10 个/ml ③评价:分离单细胞克隆系困难;▲如何降低植板密度:条件培养基,看护培养2)、看护培养:①可与细胞同源可与细胞不同源②原理:看护组织为单细胞提供营养物质及生长因子。③评价:是经典的单细胞培养方法,源于科学探索中的灵光闪耀。3)、饲养培养:①②平板法+看护法饲养培养③单细胞&原生质体培养的较理想方法;注:饲养层细胞没有种属特异性。4)、微室培养:悬滴法①1 个/ul =10  个/ml ②条件培养基or 复合培养基;③镜检不可过于频繁,单细胞培养应该尽可能在暗环境中进行。上述几种方法都着眼于细胞密度与生长因子两个方面,都是形成于20 世纪60 年代,近40 年来在细胞培养领域没有大的技术创新。细胞培养技术尤其是细胞群体培养技术目前还面临多方面的障碍,有待进一步开拓。2、影响因子:1 )、单cell 培养的关键:培养基+细胞密度2 )、单cell 培养的机制:???五、细胞培养的应用:宏观:植物cell 大量培养次生产物,生物转化;微观:单cell 培养克隆,遗传转化,植物生理,突变体筛选。1、突变体选择:体细胞无性系变异人工诱变单细胞突变体耐盐抗虫单细胞克隆再生株种苗抗AA  (突变株)抗除草剂耐旱体细胞无性系Somaclone :由任何形式细胞培养所获得的再生植株统称体细胞无性系。体细胞无性系变异Somaclonal variation :在没有任何外在选择压的情况下,由培养细胞得到的再生植株所表现出来的变异。单细胞突变体的优点:i 、处理数目多,收率高;Ii 、避免由多细胞起源产生嵌合体;单细胞突变体选择方法:1 、直接选择:i、正选择:选择抗性突变株;ii 、负选择:选择营养缺陷株;2 、间接选择:利用细胞内反应,淘汰野生型;3 、互补选择:利用不同互补突变体,选择杂种细胞;2、植物细胞大量培养产生次生代谢产物及生物转化:获得植物有用物质的途径:i 、种植;ii 、化学合成;产率高iii 、细胞培养濒危,难驯化化学合成难工业化生产1、细胞大量培养:高产细胞系建立“种子”培养产品分离纯化大量培养2 、生物转化:利用植物细胞代谢活动对特定化合物进行定向转化。eg :强心苷* * * * 滞后期对数期直线生长期减缓期静止期4 4 单细胞克隆系5 cell 滤纸片看护组织游离cell 饲养层cell (是活cell 但不能分裂)3

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