PCR 常见问题分析及解决方案重庆升博生物科技有限公司SHENGBO BIOTECH CO., LTD. PCR 技术的发明1983  Kary Mullis 发明1985  开始有文章发表1993  获诺贝尔奖广泛用于分子生物学研究领域pcr 动画.exe PCR 标准反应体系DNA 模板引物反应缓冲液Mg 2 ＋dNTP  耐热聚合酶ddH2O 反应体系对PCR 扩增的影响DNA 模板纯度蛋白、多糖、酚类等抑制PCR 反应完整性模板降解会导致PCR 扩增无产物浓度浓度适当反应体系对PCR 扩增的影响反应Buffer pH 、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境Mg 2 ＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融ddH2O pH 值适当，避免污染如何选择最合适的DNA 聚合酶PCR 用耐热DNA 聚合酶（PCR 实验的不同需求）1  Taq 酶——扩增效率最高发现1969 年，美国黄石国家公园温泉活性5‘-3’DNA 聚合酶活性强5‘-3’DNA 外切酶活性弱荧光探针（定量PCR 方法）3‘-5’DNA 外切酶活性无错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A”能产物可直接进行“TA”克隆生产质检诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD 重组蛋白。无核酸酶和细菌DNA 污染能有效扩增人基因组单拷贝基因室温放置一周，无明显活性改变。2 pfu 酶——保真度高原理具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。效率相对较低3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA 克隆。3 HotStart Taq 酶——特异性高热启动Taq 酶4 混合酶——高扩增效率＋高保真度Taq plus Taq+pfu 用于复杂模板（GC rich, 二级结构）扩增大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb 以上时，可扩10-20kb 。Long Taq Taq+pfu 超长片断扩增，15-40kb. Taq platinum HotStart+pfu 高扩增效率＋高保真度PCR MasterMix PCR Master Mix 产品特点PCR 常见问题分析PCR 常见问题无扩增产物非特异性扩增或拖尾假阳性问题1：无扩增产物无扩增产物之模板原因无扩增产物之引物原因无扩增产物之PCR 条件原因问题3：假阳性提高PCR 特异性的策略巢式PCR （Nest-PCR ）递减PCR （TouchDown PCR ）热启动PCR （HotStart PCR ）使用PCR 增强剂策略之一巢式PCR （Nest-PCR ）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成，直到PCR 仪达到变性温度通常选择热启动Taq 酶热启动PCR 是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一策略之四使用PCR 增强剂甲酰胺，DMSO ，甘油，甜菜碱等可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区增强剂浓度要适当RT-PCR 简介主要内容RT-PCR 原理RT-PCR 步骤常见问题分析两步法RT-PCR 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR 比较RT-PCR 主要用途分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA 探针逆转录酶的选择AMV ：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA 酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃（Bioflux 公司）。MMLV ：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA 酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛）Super RNaseH- Reverse Transcriptase MMLV 反转录酶的RNase H- 突变体，它能将更大部分的RNA 转换成cDNA ，最适42℃。（Tiangen 天根生化）RNase H 的作用水解RNA-DNA 杂合链中的RNA Super RNaseH- Reverse Transcriptase RT-PCR 引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA, 特异性最低。起始浓度范围为20μl 体系50-250μg 。Oligo(dT15-18) ：适用于具有PolyA 尾巴的RNA 。起始浓度范围为20μl 体系0.2-0.5μg 。特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20μl 体系1pmol 。提高RT-PCR 灵敏度分离高质量RNA  使用无RNaseH 活性的逆转录酶RT 常见问题PCR 引物设计引物的重要性引物设计是PCR 成功的关键。PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。引物设计一般原则：长度引物的长度一般为15-30 bp ，常用的是18-24 bp ，但长片段扩增时，引物长度30-35 bp 。引物过短易引起错配现象。例：一个12bp 的引物在人类基因组上存在200 个潜在的退火位点，而20bp 的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400 个. 较长的引物（28-35bp) ，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。引物设计一般原则：结构尽量避免引物序列形成发夹，特别是3‘端。尽量避免引物间形成二聚体、特别是3‘端前3个碱基间不能有二聚体。避开局部富含GC 或AT ，3’端避开连续同样的碱基，如GGG ，CCC 和AT rich. 引物设计一般原则：错配尽量避免引物在模板上有错配位点3‘端尤其不要形成非特异性结合。无法避免错配时，最好不要有产物生成。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC ，也会使错误引发机率增加。引物设计一般原则: GC 含量引物序列的GC 含量一般为40-60% ，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55% 或50-60%  引物设计软件Primer Premier5.0 （自动搜索）* Oligo6 （引物评价）Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3  （在线服务）Primer premier5.0 使用简介主要功能: 1 、引物设计2 、限制性内切酶位点分析3 、DNA 基元(motif) 查找4 、同源性分析Primer premier5.0 使用简介引物设计最常用软件引物序列自动搜索功能最强大简单易用可用于设计简并引物Primer premier5.0 使用简介Primer Premier5.0 下载、安装。www.book118.com.cn 主页之下载中心Primer Premier5.0 使用演示Primer premier5.0 使用简介Primer Premier5.0 使用步聚：粘贴序列: 复制序列>File>New>DNA Sequence>Ctrl+V, 选AS is Primer>Serch> 设置引物参数>OK 搜索完成再点OK ，选择合要求的引物序列。Blast 检查引物特异性，必要时重新设计。Primer premier5.0 使用简介Primer Premier5.0 评价引物方法粘贴序列: 复制序列>File>New>DNA Sequence>Ctrl+V, 选AS is Primer>S>Edit Primer> Ctrl+V>Analyze>Primer>OK Primer>A>Edit Primer> Ctrl+V>Analyze>Primer>OK 免费引物设计服务升博提供免费引物设计服务免费引物设计服务注意事项客户提供明确的序列客户明确引物设计要求设计报告以PDF 文件提供，打开密码为升博网址。确认合成请再发序列至升博邮箱: sbio1999@126.com Primer Premier 使用实例Human actin-beta Primer 设计演示致谢Thank you for your attention! 谢谢你的关注！mRNA 5’3’AAAAAAAA Poly(A)* 尾T T T T Oligo(dT) Super RnaseH- Reverse Transcriptase T T T T AAAAAAAA mRNA cDNA T T T T cDNA 3’5’5’3’PCR 扩增……Super RnaseH- Reverse Transcriptase 3’5’T T T T cDNA T T T T cDNA ……PCR 扩增5’3’mRNA AAAAAAAA Poly(A)* 尾3’5’3’5’大量样品分析定性检测多种目的基因半定量RT-PCR 适用特异性和灵敏度高PCR 扩增失败时便于分析原因优点GSP Oligo dT ，随机引物，GSP 引物一步法两步法MMLV 反转录酶的RNase H- 突变体逆转录效率高提高RT-PCR 特异性提高逆转录酶保温温度减少基因组DNA 污染RNA 降解或起始量少RNA 含抑制成分cDNA 5’端不全目的基因在组织中不表达或表达量太低原因对策分离高质量的RNA 使用高温逆转录酶，如RT007 （BioFlux ）使用随机引物或GSP 尝试其它组织问题1：RT-PCR 没有产物PCR RT-PCR 六种Taq 和MasterMix ：Taq 、Pfu 、HotStart Taq 、Taq plus 、Long Taq 、Taq Platinum dNTP 引物SP6,Tn7,M13 Super RNase H- Reverse Transcriptase TA 克隆系统：pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒感受态细胞DNA Marker ：22 种不同大小的分子量标准TIANGEN 相关产品S b i o. t m m u. c o m. c n 重庆升博生物科技有限公司升博生物专业服务PCR 技术的基本原理模板DNA 的变性：93℃-95℃左右，模板DNA 与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃引物的延伸：Taq DNA 聚合酶之5’-3’DNA 聚合酶活性变性-- 退火-- 延伸三个步骤1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min ）温度（℃）PCR 的基本原理适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复1~3 步25~30 轮目的DNA 片段扩增100 万倍以上DNA 双螺旋DNA 单链与引物复性DNA 变性形成2条单链子链延伸DNA 加倍引物设计长度适当、避免二级结构和二聚体合成质量浓度50uL 体系引物加量为10-20 pmol 反应Buffer pH 、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境Mg 2 ＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融ddH2O pH 值适当，避免污染反应Buffer pH 、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境Mg 2 ＋浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融ddH2O pH 值适当，避免污染1 Taq 酶2 pfu 酶3 Hotstart Taq 酶Taq plus Long Taq Taq platinum 4  混合酶用途表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP ）原理蜡封抗体抑制化学修饰提高PCR 特异性，减少甚至避免非特异性扩增3‘加“A”，可直接做“TA”克隆用途混杂模板半定量、定量PCR 根据PCR 实验的不同需求基因组扩增、RT-PCR ———————特异性基因突变、测序、表达克隆—————保真性构建基因图谱、测序等——长片段扩增复杂模板扩增(GC 含量高、二级结构) —扩增效率预配的PCR 反应液DNA 聚合酶反应缓冲液dNTP PCR 增强剂特点快速简便减少加样误差和污染灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板特异性强降低PCR 反应的要求，增强特异性稳定性好-20℃一年以上，反复冻融不影响活性。适用范围大规模基因检测目的基因拷贝数极低的样本GC 含量高,有二级结构的模板复杂基因组样本现象：正对照有条带，而样品则无M 样品A 样品B 正对照纯度：含有抑制物浓度：含量低质量：全长结构：二级结构原因对策纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA 加大模板的用量用好的反转录酶用温度高的反转录酶引物错误引物设计不好引物降解引物合成、纯化不好原因对策合成前检查评价、重新设计引物换一管新引物免费重新合成退火温度延伸时间循环次数原因对策递度PCR 聚合酶的延伸速度适当增加循环数现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题2：非特异性扩增M 1 2 引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+ 浓度偏高退火温度偏低循环次数过多原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数非特异性扩增靶序列或扩增产物的交叉污染原因开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外更换试剂、耗材试剂分装，贮存适当。更换实验室和所有试剂耗材。　现象：空白对照出现目的扩增产物对策四种策略P1 P2 P3 P4  增加有限量靶序列（如稀有mRNA ）的灵敏度降低了扩增多个靶位点的可能性提高困难PCR （如5‘RACE ）特异性前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃, 直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP 、DNA 指纹分析等。策略之二递减PCR （TouchDown PCR ）策略之三热启动PCR S b i o. t m m u. c o m. c n 重庆升博生物科技有限公司