临床基因扩增检验操作规范浙江省基因诊断中心浙江大学医学院附属儿童医院尚世强一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR 污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能规范化设置：要求参照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002] 10号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。2. 明确的标记，如加样器或试剂等。3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。6. 各自的清洁用具。各室功能：（一）试剂贮存和准备区功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254 nm 波长）照射，一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。（二）标本制备区功能：临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA 的合成。要正确使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于RNA 扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA 合成。（三）扩增区功能：DNA 或cDNA 扩增。已制备的DNA 模板和合成的cDNA 的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR 测定中，第二次加样必须在本区内进行。可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。（四）扩增产物分析区功能：扩增片段的测定。膜上微孔板上探针杂交方法、Southern 转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。负压条件。二、各阶段操作要求测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。（一）标本的采集临床标本包括EDTA 或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。EDTA 和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq 酶的强抑制剂。玻璃器皿在使用前应高压处理，250°烘烤4小时以上可使RNA 酶永久性失活。临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA 的降解。（二）标本的稳定化处理DNA：不需特殊稳定化处理。RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使DNA 酶和RNA 酶失活。（三）标本的运送可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA 扩增检测的EDTA 抗凝全血及用于RNA 扩增检测的GITC 稳定化处理的标本。未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。（四）标本的贮存1. 血清/血浆等—-70℃2. 用于DNA 测定的已纯化核酸样本—4℃3. 用于RNA 测定的已纯化核酸样本—-80℃4. 用乙醇沉淀的核酸样本—-20℃5. GITC 处理的RNA 标本在室温可保存7天（五）标本的处理（核酸提取）抑制物可能来源于：标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。痰须液化处理。操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：①离心管不能插得过低，以防进水；②水浴时不能加盖，防管盖爆开；③水浴时间须准确，10±1 min；④水浴时不能走开；⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq 酶失活、退火温度不对、Mg++ 浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。RT-PCR 操作注意：①标本必须新鲜；②做RNA 标本的枪头离心管必须无菌；③冰上操作；④处理完后须立即上机，不能放置；⑤注意左右手分开。（七）扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。实时荧光定量PCR 在荧光定量PCR 基础上实时监测PCR 全过程，最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR 使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR 一般使用Ct （每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct 与模板初始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光PCR 的优点：　精密度高，重复性能好。TaqMan 荧光定量PCR 原理探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，Taq DNA 聚合酶的5’-3’外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；三、PCR 污染与对策PCR 污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR 污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第三、PCR 产物的污染（Carryover）。要防止PCR 污染，必须做好以下3个环节的工作：（一）污染的预防（二）污染源的追踪（三）污染源的处理（一）污染的预防操作PCR 时，按照下述规则可有效地预防PCR 的污染。1、PCR 的前处理及后处理要在不同的隔离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标记批号3、改进实验操作：(1) 带一次性手套；(2) 避免反应液的飞溅；(3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于空气，以免产物气溶胶污染；(4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分( dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准混合液( Master mix)；(5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA，加入DNA 后，在进行下一步操作前要盖紧反应管。4、检查结果的可重复性。（二）污染源的追踪1、阳、阴性对照选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品。阴性对照的选择一定要小心。不含模板DNA 的PCR 试剂对照。2、常见的环境污染源有(1) 点杂交的点样器；(2) 切片机；(3) 离心机；(4) 切胶用刀或微解剖刀；(5) 浓缩用具，真空瓶；(6) 电泳装置和紫外灯箱；(7) 干冰/乙醇或水溶锅；(8) 冰箱门把手、冷冻架和门把手。追踪可疑的环境污染源①用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分②在0.1 ml 去离子水中浸泡；③取5 μl 作PCR 反应；④电泳检查结果。（三）污染源的处理1. 环境污染处理法（1）稀酸处理法。对擦试实验阳性部位或器件可用1 mol/LHCl 擦洗或浸泡残留DNA。（2）紫外法：UV 照射波长一般选择254/300 nm，需考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV 对长片段（500 bp 以上）有效，而对短片段效果不大。2. 反应液的污染处理法(1) DNaseI 法：PCR 混合液（不加模板和Taq 酶）中加入0.5 U DNaseI，室温下作用30 min 后，加热灭活，加入模板和Taq 酶后即可进行正常PCR。优点：便宜，不需知道扩增DNA 序列。(2) 内切酶法：选择识别四个碱基的内切酶（如MspI 等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI 由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.0～1.5 h。(3) 紫外照射法：反应中不加模板与Taq 酶。(4) 尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG）法：dUTP 代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG 可去除dU，使失去dU 的位置，阻止Taq 酶的延伸。PCR 正常循环前，用UNG 处理PCR 反应混合液可消除PCR 产物的污染，而UNG 在正常PCR 循环变性一步就会失活，所以，对含dU 的新合成PCR 产物没有影响。该法优点：①去除任河来源（包括引物在内）的污染；②由于污染的产物有大量dU 存在，因此，UNG 处理会彻底消除污染。③UNG 处理与PCR 扩增可在同一试管内进行。四、因操作欠规范导致的问题分析（一）实验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳定，引起假性结果。旋涡混合器，微量加样器，正规的紫外透射仪。RNA PCR 样品处理时，血清（或血浆）中加入强烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。吸头与微量加样器不配套。2、PCR 热循环仪的差异或质量问题。移液器：①严禁大力来回拧动；②严禁调至容量之外使用；③第二档为排空档，不得作吸取之用；④吸头应浸入液面2—3 mm 处吸取；⑤严禁将有液体的移液器平放或倒置；⑥混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。离心机：①离心前，离心管须配平；②将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；③定时旋钮不能强行归零；④转头未停止时，严禁打开盖板。（二）实验室布局不合理引起的污染问题1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片段均会通过空气进行传播。2、PCR 结果检测实验室和其它实验室在一起，会出现严重的扩增子污染。3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公用，也会造成严重污染。4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯等）乱放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室污染。（三）PCR 操作中存在问题分析1. 阳性变阴性2. 阴性变阳性3.PCR 结果不稳定1. 阳性变阴性 (1) 有些阳性病人，经过PCR 检测后为阴性，可能有两种情况：一是采集标本方法或部位不正确，二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。(2) 标本保存不当，可引起PCR 失败。收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR 检测的模板或造成标本污染。2. 阴性变阳性常见的原因有以下6点：①加入试剂或样品时引起的交叉污染（最好在加完所有其他反应成分，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA，将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心[10秒]，使水相和有机相分开）。②加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染（将模板DNA 加入PCR 系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。③打开标本管盖引起样品飞溅（打开前须瞬间离心）④操作时手套引起的交叉污染（拿过模板DNA