PCR 引物设计软件primer Premier 5.0  应用简介温州医学院附属第一医院检验科陶志华一. 引物设计的基本原则引物长度（primer length ）产物长度（product length ）序列Tm 值(melting temperature) ΔG 值(internal stability) 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin ）错误引发位点（false priming site ）引物及产物GC 含量（composition ）1. 引物的长度一般为15-30bp ，常用的是18-27bp ，但不能大于38 ，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度2. 引物3’端的序列引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败3. 引物的GC 含量 一般为40-60% ，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右5. ΔG 值(自由能) ，反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG 值较高，而3’端ΔG 值相对较低6. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5 ，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行二. Primer Premier 5.0  引物设计软件简介Primer Premier 5.0 用途： 引物分析评价功能；引物的自动搜索功能Premier 的主要功能：* *