蛋白质化学一、什么是蛋白质? 蛋白质(protein) 是由许多氨基酸(amino acids) 残基通过肽键(peptide bond) 构成多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按一定的方式组合成具有特定结构的生物活性分子。组成蛋白质的元素蛋白质元素组成的特点由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：四、蛋白质的分类一、氨基酸 ——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300 余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸仅有20 种另外：1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修饰的——修饰氨基酸如：脯氨酸羟基化成羟脯氨酸赖氨酸羟基化成羟赖氨酸2 、半胱氨酸Cys 常以胱氨酸的形式存在(1) 与印三酮的反应(2) 与甲醛的反应取代DNFB 测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高（4）与异硫氰酸苯酯（PITC ）的反应蛋白质的结构The Molecular Structure of Protein 蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。1. α- 螺旋：2.  -折叠β- 折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象3. -转角是多肽链180° 回折部分所形成的一种二级结构无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。4. 无规卷曲三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和Van der Waals 力等。主要的维系键：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。三级结构是蛋白质结构的基础对于单一多肽链的蛋白质，三级结构是它的最高级结构，只有具有完整的三级结构，才具有全部的生物学功能（一）定义肌红蛋白(Mb) N 端C 端为单肽蛋白质，含有153 个氨基酸，有8个螺旋区（二）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。四、蛋白质的四级结构亚基(subunit) 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基。胰岛素受体：由4个亚基组成(α2β2) ，α亚基与β亚基形成单体(monomer) ，2个单体形成二聚体(dimer) 。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。血红蛋白的四级结构蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein （一）蛋白质的两性电离一、理化性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点( isoelectricpoint, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为（二）蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100 万之巨，其分子的直径可达1～100nm ，为胶粒范围之内。* 蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷(电荷层）水化膜+ + + + + + + 带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+ + + + + + + + 带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变性的本质破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。变性蛋白质的性质改变①物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。* * Structure and Function of Protein 1）生物催化作用——酶二、蛋白质具有重要的生物学功能几乎所有的酶都是蛋白质2）调控作用参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等参与代谢调控：如激素或生长因子等3）运动与支持运动：动物肌肉收缩、细菌的鞭毛运动机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等4）运输与贮存血红蛋白——运输氧铜蓝蛋白——运输铜铁蛋白——贮存铁5）免疫保护抗原抗体反应凝血机制另外，蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面起到重要作用有些蛋白质还含有少量的P、Fe 、Cu 、Mn 、Zn 、Se 、I等。C 50 ~ 55 %  H 6 ~ 7  % O 19 ~ 24 % N 13 ~ 19 % S  0 ~ 4  % 主要元素组成三、蛋白质的分子组成各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16 ％。100 克样品中蛋白质的含量( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100 1/16% 凯氏定氮法：* 根据蛋白质组成成分单纯蛋白质：如，血清清蛋白结合蛋白质= 蛋白质部分+ 非蛋白质部分（辅基）如：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白等* 根据蛋白质形状纤维状蛋白质：多为结构蛋白，难溶于水球状蛋白质：多数具有生理活性，多数可溶如酶、免疫球蛋白等等* 根据蛋白质来源植物蛋白质动物蛋白质微生物蛋白质L- 氨基酸的通式：氨基酸的通式：氨基酸的结构通式：19 种氨基酸具有一级氨基（-NH3+ ）和羧基（-COOH ）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R）；Pro 具有二级氨基（α- 亚氨基酸）非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸（二）氨基酸的分类分类依据：R侧链基团的结构及理化性质的不同甘氨酸glycine  Gly G  5.97 丙氨酸alanine Ala  A  6.00 缬氨酸valine Val  V  5.96 亮氨酸leucine Leu  L  5.98  异亮氨酸isoleucine Ile  I  6.02  苯丙氨酸phenylalanine Phe F  5.48 脯氨酸proline Pro P  6.30 非极性疏水性氨基酸色氨酸tryptophan Try  W 5.89 丝氨酸serine Ser  S  5.68 酪氨酸tyrosine Try  Y 5.66  半胱氨酸cysteine Cys  C 5.07 蛋氨酸methionine Met M 5.74 天冬酰胺asparagine  Asn  N 5.41  谷氨酰胺glutamine  Gln  Q 5.65 苏氨酸threonine Thr  T  5.60 2. 极性中性氨基酸——侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷。(天冬氨酸、谷氨酸）3. 酸性氨基酸Glu ，Asp 4. 碱性氨基酸His ，Arg ，Lys ——侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷。(赖氨酸、精氨酸、组氨酸）（三）氨基酸的理化性质1. 两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。+OH- +H+ +OH- +H+ pHpI 阴离子等电点(isoelectric point, pI) 等电点：在某一pH 的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH 值称为该氨基酸的等电点。氨基酸等电点的特点：净电荷数等于零，电导性最差、在电场中不移动（电泳迁移率最小）；此时氨基酸的溶解度最小（最不稳定）。氨基酸等电点的确定：酸碱滴定：等电点等于两性离子两侧pK 值的算术平均数。紫外分光光度法：色氨酸和酪氨酸的最大吸收峰在280 nm 附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm 的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。pI = ————pK1+pK2 2 或（pI = ————）pK2+pK3 2 (1) 茚三酮反应：在弱酸性溶液，氨基酸可与茚三酮共热缩合产生蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm 。该反应可作为蛋白质定性、定量分析的基础。(2) 甲醛反应：(3) 2,4- 二硝基氟苯（DNFB ）反应：在弱碱性溶液中，氨基酸与DNFB 反应产生黄色化合物。(4) 异硫氰酸苯酯（PITC ）反应：在弱碱性条件下，氨基酸与PITC 反应产生无色化合物，再用层析法加以分离鉴定（Edman 用于鉴定多肽或蛋白质的N- 末端氨基酸）。2．氨基酸的化学性质R—CH—COO- NH3+ R—CH—COO- NH2 + H+ R—CH—COO- NHCH2OH HCHO HCHO R—CH—COO- N(CH2OH)2 OH- 中和滴定（3）与2,4- 二硝基氟苯(DNFB) 的反应—N=C=S  +  N—CH—COOH H H R PITC pH8.3 —N—C—N—CH—COOH H H R S PTC- 氨基酸—N—C H R S N C C O PTH- 氨基酸无水HF 重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”肽(peptide)  肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。肽键(peptide bond) ：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。氨基酸残基(residue) : 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。N 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有方向性：Ala-Tyr-Asp-Gly N  C N端C端牛核糖核酸酶N端C端蛋白质的分子结构包括一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 高级结构定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。由N指向C。(包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）一、蛋白质的一级结构主要的维系键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素二、蛋白质的二级结构氢键：由电负性较强的原子与氢形成的基团如N－H和O－H具有很大偶极距，成键电子云分布偏向电负性大的原子核，因此氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核（质子）就在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，产生静电吸引x —H …y 定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象主要的维系键：氢键肽键平面——由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。（一）肽单元由于α- 碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转( 二）蛋白质二级结构的主要形式-螺旋( -helix )  -折叠( -pleated sheet ) -转角( -turn ) 无规卷曲( random coil )