Chapter 3 Cell Engineering 第3 章细胞工程目的要求【掌握】动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程的基本原理；动植物细胞及组织的培养方法；单克隆抗体的制备原理和步骤。【熟悉】干细胞的概念与用途；利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本过程及其重要意义；单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领；植物脱除病毒的途径和检测手段。【了解】制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法；细胞工程与现代生物技术的关系；细胞工程的发展与相关学科的联系。3.1 细胞工程的基础知识与基本技术www.book118.com.2 细胞培养技术取样灭菌培养传代收获除菌取样细胞培养是指动物、植物或微生物的细胞在体外无菌条件下的存活和生长技术，此时细胞不再分化成组织。组织培养是指从机体内取出组织或器官，在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）的条件下或模拟机体内生理条件下，在体外进行培养，使之生存或生长，甚至发育出个体的技术。习惯上，动物学和医学上往往用组织培养(tissue culture ) 这一术语泛指细胞、组织和器官在适当的培养条件下离体生长的技术。3.2 植物细胞工程MS 培养基细胞分裂素类激素愈伤组织是离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织（松散的细胞团）。www.book118.com.3 继代增殖阶段www.book118.com 植物细胞培养和次生代谢物生产紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中，其中树皮中的含量最高，大约从12000 株成年紫杉树中才能提取1Kg 的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。紫杉醇的国际市场价格为450 美元/g 日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4 周就增殖了5 倍，紫杉醇的含量达到了0.05 ％，比树皮中紫杉醇的含量高达10 倍。Ketchum 从6 种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L 。清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4 周内获得20g/L 干物质，利用代谢调控技术在2~3 天内将紫杉醇的含量提高到0.063% 左右。www.book118.com 植物原生质体制备与融合原生质体的分离聚乙二醇（PEG ）的作用1 、PEG 可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG 作用打开细胞膜（尤其在高钙、高pH 条件下），使细胞融合。2 、PEG 可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。3 、PEG 可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而膜融合。PEG 诱导细胞融合的效果：同其分子量大小及浓度高低相关。常用分子量为1000 －6000 ，浓度为30 －50 ％PEG 使细胞融合或致死的剂量界限很狭。须严格掌握PEG 的处理时间。悬浮法，处理1 －2 分钟为宜。离心法，先将细胞混合物悬于30 －40 ％的PEG 中，再通过离心进行融合，可适当延长接触时间，以5 －8 分钟为宜。随后，均须立即加液稀释，以及时终止PEG 作用。野生马铃薯和栽培马铃薯细胞融合“番茄- 马铃薯”植物脱毒技术的意义物理方法：温度（高温）化学方法：孔雀绿等（难）生物学方法：芽尖、根尖综合脱毒方法生物学方法茎尖培养茎尖越小越没病毒，但越小越难成活, 一般要超过2 万个细胞，或至少3~10 mg 茎尖。花瓣培养花药培养生物学脱毒方法的基本流程植物脱病毒进展3.3 动物细胞工程细胞株（cell strain)  指通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物或细胞。通常把原代细胞和50 代前的传代细胞叫做细胞株。细胞系（cell line)  原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物，包括有限细胞系和连续细胞系。细胞系着重于指传50 代后，遗传物质发生了改变，并且有癌变的特点，无限传下去的传代细胞。www.book118.com.4 无血清培养培养液（液体培养基）：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。细胞和组织的体外培养一般都需添加一定量的血清，不仅价格昂贵、容易混进污染物( 包括病毒和病菌) ，而且其成分不能完全确定，不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。www.book118.com.5 培养物的长期保存目前最常用的是液氮保存法：将成熟培养物( 细胞) 与5% ～10% 的甘油或二甲亚砜（DMSO ）混匀，封装于若干个安瓿瓶中；缓慢降温(1 ～3℃/min) 至-30℃；继续降温(15 ～30℃/min) 至-150℃；转移至液氮冻存，可无限期保存。DMSO DMSO 既能降低细胞的新陈代谢，又能维护膜的强度、使水分不易进入细胞而影响其冻存。DMSO 无须灭菌处理，因为DMSO 本身对细菌有毒性作用，可自身灭菌。DMSO 不适合高压灭菌或滤膜过滤。高压可使其毒性增大，而滤膜可被其溶化。www.book118.com 动物细胞融合www.book118.com.1 病毒诱导融合杂种细胞筛选HAT 培养基筛选融合细胞的原理在细胞融合时，可以出现：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，脾细胞之间的融合，骨髓瘤之间融合，此外还有大量的未融合细胞。如何除去大量未融合及自身融合的细胞呢？HAT 培养基可对杂种细胞进行选择。HAT 系次黄嘌呤（hypoxantin ）、氨基蝶呤（aminopterin ）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin ）三种物质英文首字母的缩写，HAT 培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。在细胞内合成核苷酸具有从头合成途径（de novo pathway ）和补救合成途径（salvage pa-thway ）。由于氨基蝶呤可阻碍从头合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有补救合成途径。缺失补救合成途径的细胞可失去增殖能力而死亡。骨髓瘤细胞株是经过8- 偶氮鸟嘌呤筛选出来的，不含HGPRT （次黄嘌呤- 鸟嘌呤- 磷酸核糖转移酶），因此不能用补救途径合成DNA ，只能靠从头途径合成DNA ，但该途径又被氨基喋呤阻断，因此细胞死亡。免疫鼠脾细胞，虽含有HGPRT 但不适应体外培养，一般十天左右自然灭亡。杂交细胞，在融合时脾细胞的HGPRT 被带入，通过补救途径利用H·T 合成DNA ，并继承骨髓瘤细胞体外繁殖的特性，所以能存活。淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体www.book118.com 细胞核移植与动物克隆克隆哺乳动物基本途径www.book118.com 染色体转移微细胞介导染色体转移方法微细胞与受体细胞融合www.book118.com 干细胞研究干细胞（stem cell ）的概念干细胞的特征干细胞分类造血干细胞造血干细胞表面标志物干细胞研究“三步曲”获得干细胞系干细胞培养胚胎干细胞的培养建立干细胞诱导分化模型效果考察干细胞治疗的优点神经干细胞治脑瘫干细胞器官工程的难点3.4 微生物细胞工程谢谢！一、单项选择题1 、在一个生物体内，细胞没有表现出全能性，原因是（）Ａ．细胞失去了全能性　　　　　　　Ｂ．细胞中的基因部分丢失Ｃ．细胞中的基因选择性表达　　　　　Ｄ．细胞中的基因变异不同3 、植物细胞融合完成的标志的是（）A 、细胞核发生融合B 、细胞膜发生融合C 、细胞质发生融合D 、产生新的细胞壁4. 通过细胞杂交, 获得一个杂种植株, 需要的步骤是( ) A. 分离原生质诱导原生质融合生出细胞壁组织培养法得到杂种植株B. 分离原生质原生质自然融合组织培养杂种植株C. 获取细胞原生质融合组织培养杂种植株D. 获取细胞原生质直接融合组织培养杂种植株5 、用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合后可得到杂交细胞，经筛选培养可产生大量的单克隆抗体。那么，与骨髓瘤细胞融合的是（）A 、没经过免疫的T 淋巴细胞B 、经过免疫的T 效应细胞C 、经过免疫的效应B 淋巴细胞D 、没经过免疫的B 淋巴细胞7 、下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是A ．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压B ．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化C ．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织D ．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同二、名词解释细胞工程tissue culture 愈伤组织次生代谢物这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传25 代以上）；饲养层细胞提供附植环境饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑制分化起重要作用；人类胚胎干细胞（ESC ）可用小鼠纤维母细胞作饲养层，但效果不十分理想；可用人输卵管上皮细胞作饲养层。培养液将胚胎干细胞置于滋养层上；放入CO2 （5% ）培养箱中，37~39℃, 饱和湿度；培养液：DMEM + 15% 胎牛血清+LIF+EGF （表皮生长因子）+IGF （胰岛素样生长因子）+ 胰岛素+β- 巯基乙醇。可利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置换改造）探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学和（或）物理条件将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织中，考察其效果。2006 年12 月27 日旅美学者张曙光等报道，发明了一种由蛋白质纳米纤维组成的三维支架结构，其中每个蛋白质纤维是人的头发丝的1/5 000 ，支架结构中包含的孔洞是针眼的1/20 000 。干细胞能够在这种“脚手架”上生长、繁殖并分化成脑细胞。这种“脚手架”比现有的任何细胞培养系更接近生物活体本身。低毒性（或无毒性），一次治疗有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。2005 年6 月6 日海军总医院宣布为一名刚出生70 多天的脑瘫患儿娜娜进行神经移植手术取得了成功。医生先从流产胎儿大脑中取出脑组织进行细胞培养和扩增，然后在娜娜头颅上穿刺，在B 超的引导下，用探针将健康的神经干细胞种进娜娜受损的大脑。17 天后，娜娜会笑了，眼神灵活了，可以玩拨浪鼓，还能认出妈妈，智力发育已经追上了同龄婴儿。这种治疗小儿脑瘫的方法尚属世界首例。地球重力限制了细胞的三维生长；离体培养难以确保器官形成所需的多种条件；细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究清楚；思考题：1. 解释下列术语：　tissue culture ；愈伤组织；次生代谢物；原代与传代培养；细胞株与细胞系；干细胞；外植体；原生质体2. 细胞工程是什么？它包括哪些研究内容？举例说明它在实践中的应用。3. 植物组织培养技术主要包括哪些环节？各环节的主要工作内容？4. 请阐述单克隆抗体的制备过程。5. 请阐述动物克隆的程序