通过HPLC 方法筛选HSCCC 溶剂条件的优势在于1 、提高效率2 、节省溶剂用量3 、可获得相对合适的溶剂条件利用分析型高速逆流色谱仪(TBE-20A) 筛选溶剂条件：1. 效率高2. 重现性佳（分析型到制备型）分析型HSCCC 制备型HSCCC 一. 高速逆流色谱在中草药有效成分提取分离中的应用高速逆流色谱技术的应用领域溶剂体系: 石油醚: 乙酸乙酯: 甲醇: 水(V/V) ＝5:5:5:5 ，5:5:6:4 ，5:5:6.5:3.5( 梯度洗脱) ；进样量＝150mg( 蛇床子提取物) 100 ％95 ％99.6 ％99.7 ％100 ％HSCCC 分离纯化香豆素类化合物实例1 样品的HSCCC 图谱样品的HPLC 图谱* 注：Ⅵ是未知化合物，纯度为98.1 ％* 引用文献:Journal of Chromatography A,1055(2004)71-76 溶剂体系: 石油醚: 乙醇: 乙醚: 水(V/V) ＝5:4:0.5:1 ，进样量＝658mg 姜黄根挥发油* 引用文献:Journal of Chromatography A,1070(2005)207-210 *HSCCC 馏分的HPLC 纯度检测，纯度>95 ％实例2 HSCCC 分离黄酮类化合物实例3 溶剂体系：正己烷: 乙酸乙酯: 甲醇: 水(V/V) ＝5:6:6:6 进样量＝400mg 白花败酱粗提物*引用文献：Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50 HSCCC 馏分的HPLC 纯度检测结果1. 99.2 ％，www.book118.com ％，www.book118.com ％朝鲜淫羊藿的分离实例4 溶剂体系：氯仿: 甲醇: 水(V/V) ＝4:3.5:2 进样量＝200mg 朝鲜淫羊藿提取物*引用文献：Journal of Chromatography A,1064(2005)53-57 HSCCC 馏分的HPLC 纯度检测结果www.book118.com ％，www.book118.com ％，www.book118.com ％HSCCC 分离生物碱类化合物实例5 溶剂体系：正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水(5:5:7:5,v/v) 样品：吴茱萸粗提物180mg 1.Evodiamine; 2.rutaecarpine; 3.evocarpine; 4.1-methy-2-[(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone; 5.1-methy-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone; 二. 高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用溶剂体系：石油醚- 丙酮- 水（3:3:2,v/v ）样品：250mg  环孢菌素粗品检测条件：ELSD 环孢菌素A －98.6% ，90.2%( 收率) 环孢菌素C －99.3 ％，85.0%( 收率) 环孢菌素B －98.7 ％，88.5%( 收率) 环孢菌素D －98.5 ％，86.3%( 收率) 实例6 溶剂体系：正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水（2:3:4:2.5,V/V ），检测波长：254nm ；柱温：25℃；进样量：300mg I+ I I I I I 异戊酰螺旋霉素I+ 异戊酰螺旋霉素I I ＝95 ％以上异戊酰螺旋霉素I I I ＝95 ％实例7 三. 高速逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用利用HSCCC 分离标准蛋白质混合物1 2 3 溶剂体系：PEG1000- 磷酸盐体系- 水＝14-16-70(%,w/w) 样品：1mg 细胞色素C 、20mg 溶菌酶、5mg 血红蛋白1. Cytochrome C;  2.Lysozyme ;  3.Hemoglobin ( 反转出峰，上相为流动相) *引用文献：色谱，2005,Vol.23 No.1 12 ～17 实例8 溶剂体系：PEG1000- 磷酸二氢钾- 水＝15-17-68(%,w/w) 样品：1mg 细胞色谱、8mg 肌红蛋白、20mg 溶菌酶1.Cytochrome C; 2.Myoglobin 3.Lysozyme 实例9 利用HSCCC 从鸡蛋清分离了高纯度卵白蛋白1 2 1 2 3 Sigma 鸡蛋清蛋白质干粉鸡蛋清样品溶剂体系：PEG1000- 磷酸二氢钾- 水＝16-17-67(%,w/w) 样品：鸡蛋清蛋白质干粉150mg ；鸡蛋清样品240mg 实例10 Lane  6 5 4  3  2 1  97 kD  6 6kD  4 3kD 31kD 20kD 14kD Lane 1: protein marker Lane 2: hen egg white sample  Lane 3: peak 1 Lane 4: peak 2 Lane 5: standard Lane 6: upper stationary phase sample  洗脱峰2卵白蛋白纯度为99 ％，整体收率为95% * 引用文献：生物工程学报，2005,Vol 21 No.1 129 ～134 四. 高速逆流色谱在其他领域中的应用1. 高速逆流色谱在中药指纹图谱研究中的应用2. 高速逆流色谱在微生物发酵产物分离纯化中的应用3. 高速逆流色谱在食品行业中的应用4. 高速逆流色谱在化学合成中的应用5. 高速逆流色谱在金属分离中的应用等等展望高速逆流色谱是一种独特的不用固态载体的连续液- 液分配色谱制备分离技术，经过近30 年的发展产生了多种新型高效分离技术，并在天然产物、生物医药、生命科学、食品等领域的研发中得到了广泛的应用，尤其是在天然药物活性成分的分离制备方面其优势得到了充分的发挥。尽管到目前为止，还有许多理论和技术问题需要深入的研究解决，但是由于其具有许多其它色谱分离技术不可替代的优点，随着各种相关技术的不断发展和完善，将会在制药等相关领域发挥越来越重要的作用。高速逆流色谱的技术原理及应用领域上海同田生物技术有限公司公司位于上海张江科技园，占地约30 亩，建筑面积约20000 平方米，总投资人民币6000 万元，其前身是成立于1999 年2 月位于深圳市清华大学研究院的深圳市同田生化技术有限公司。 公司致力于高速逆流色谱仪（HSCCC ）、高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料/ 中间体的研究开发、生产和销售。 作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者，我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司（GE Healthcare Bio-sciences co.,ltd . ）建立了长期的合作伙伴关系. TBE300A ＋KTA Prime 在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等7种不同产品：泰国德国国内最大最早的专业对照品标准品研发及生产企业之一拥有长达8年的对照品研发及生产经验配备有完整的对照品研发中心,检测中心和生产中心(对照品高速逆流色谱生产线)  同田对照品纯度达99%以上,均通过严格的质量检测,包括HPLC,NMR,MS,UV 等方法的鉴定. 银杏内酯B 银杏内酯A 银杏内酯C 部分对照品获得国家质量监督检验检疫总局颁发的标准物质证书天然植物<银杏,大豆>单体提取物-上海市高新技术成果转化项目<石杉碱甲>-上海市高新技术成果转化项目同田对照品质量目前已得到美国，德国，瑞士，英国，新加坡等多家标准品经销商及科研院校的认可，公司与国内外多家科研单位保持长期稳固的合作。高速逆流色谱High Speed Counter-Current Chromatography 一、逆流色谱(CCC) 原理及分类二、高速逆流色谱(HSCCC) 的原理三、高速逆流色谱的应用实例逆流色谱的原理液－液分配色谱：利用样品中各组分在两相溶剂间分配比的差异，进行分离。它是不用固态载体的全液态的液- 液分配色谱技术. 优点：不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为100 ％极大地避免了样品的变性问题操作简单，无需太多样品前处理等。20 世纪50 年代，逆流分溶法(CCD) 由Craig 发明的非连续性分溶装置( 设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化、溶剂耗量大、分离时间太长) 20 世纪60 年代被液相色谱代替20 世纪70 年代，逆流色谱(CCC) 。首先出现液滴逆流色谱(DCCC) 收集器进样器溶剂泵约300 根管柱上行法收集器进样器溶剂泵约300 根管柱下行法优点：DCCC 仪器轻巧简便，能避免乳化或泡沫的产生。缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．液滴逆流色谱(DCCC) 旋转腔室逆流色谱(RLCCC) CCC HSES 恒定的引力场HDES 可变的引力场引力离心力离心力同步行星式运动RLCCC CPC DCCC HSCCC 逆流色谱的分类流体静力学平衡( HSES) 流体动力学平衡( HDES) 逆流色谱的基本体系示意图高速逆流色谱(HSCCC) 的原理固定相的保留原理如上图所示，螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合静置区：两溶剂相分成两层较重的溶剂相在外部较轻的溶剂相在内部转速：800rpm 13 次/ 秒混合分离在分离柱运动一个周期时（经过《分离区》、《混合区》、《分离区》）的两相分配过程分离管内侧———————————————————————————————————————………………………………ooooo……ooooo②……oooo………………………………………………………………………………ooo…………oooo………………③………………………………………………………oooo①oo……ooooooo……oooo…①……………………………①②③④ooooooooooooooooooooooooo……③……oooo…………ooooooooooooooooooooooooooooooo ooooooooooooooooooooooooo…oo……ooo④oo……ooo…ooooooooooooo④oooooooooooooo  oooooooooooooooooooooooooo………oooo……oooo………oooooooooooooooooo②ooooooooo ———————————————————————————————————————分离管外侧①③组分，由于在轻相中的分配系数过大不易被流动相洗脱下来②④组分，根据在重相的分配系数大小按顺序洗脱出来分离区 ………………――――轻相oooooooooooo――――重相①②③④——样品（4 组分）高速逆流色谱中样品分离原理HSCCC 的工作流程简易图HSCCC 分离条件HSCCC 的溶剂条件选择HSCCC 采用液- 液分配原理，增加了固定相选择环节，因此它的溶剂条件选择方法与其他色谱技术不同。1 、文献报道的溶剂条件经典体系1 ：氯仿- 甲醇- 水：4-3-2 经典体系2 ：正己烷- 乙酸乙酯- 乙醇- 水：1-1-1-1 2 、TLC 方法初步筛选初步判断样品在上、下相中的分配情况3 、HPLC 方法分析分配系数分析目标组分在两相中的分配系数K 值4 、利用分析型HSCCC 时间短、溶剂消耗少等优点溶剂条件的筛选方法用分析型HPLC 筛选溶剂体系，主要是利用HPLC 来确定溶质的分配系数，分配系数K=CS/CM 或CU/CL HSCCC 最合适的K 值范围是0.5 －2  当CS/CM ＜＜0.5 时，出峰时间太快，峰之间的分离度较差，当CS/CM ＞＞2 时，出峰时间太长，且峰形变宽根据文献报道，筛选出芦荟甙HPLC 分离的色谱条件，得到芦荟甙提取物的HPLC 图谱如下，1 芦荟未知物，2 芦荟甙A ，3 芦荟甙B 实例－上层－下层体系氯仿/ 异丁醇/ 甲醇/ 水4 ：0.25 ：3 ：2 目标物质芦荟未知物芦荟甙A 芦荟甙B 分配系数K 0.9 1.9 2.3 300BHSCCC 保留时间2.3h 4.0h 5.3h 样品的HSCCC 分离图谱