高效液相色谱法在中药质量标准提高中的应用广东省药检所――李华前言中药是中国医药学的瑰宝，对中华民族的繁衍昌盛做出了伟大的贡献。为了保证中药的安全性和有效性，数千年来中医药一直处于不断标准化、规范化的进程中，《神农本草经》则是最早的中药材标准。李时珍的《本草纲目》是中药材标准规范的深化。历史发展到今天，总结前人经验，补充完善、制定中药系列标准是中药现代化的需要，也是中药国际化，造福全人类的需要。一、我省中药材质量标准状况1、部分中药材无质量标准。　　广东是一个中药材生产、销售、使用的大省，我省用于生产中药成方制剂及临床配方的中药材有上千种，《中国药典》2005 年版收载的中药材有551 种；现有质量标准的中药材远不能满足我省中药材的需求和使用，尚有数百种经常使用、疗效较好的广东地产中药材，既无国家药品质量标准也无省级药品质量标准。二、高效液相色谱法在国家药品标准中的运用　　高效液相色谱法由于仪器化程度高、分离效能高、准确性和重现性好，更适合中药复杂成分的分离分析和标准色谱图库的建立，成为中药含量测定的主导方法。　表1  部颁品种量化指标方法分析（二）、HPLC 在《中国药典》的应用　HPLC 在《中国药典》的应用，在我国药学工作者的努力下，经历了一个从无到有、从少到多的过程。三、运用高效液相色谱法进行药品标准定量部分提高工作　　中药是多种成分的混合物，其化学成分可有几十种甚至上百种，虽然中药药效是多成分综合作用的结果已渐成共识，但由此认为中药全成分均为有效成分的观点则是片面的，以我们目前的技术及实验条件要想对所有的成分进行测定也是不可能的，选择1~ 2 个有效成分作为中药质量评价的标准，虽然这种方法不够充分、客观，但却是目前我们的技术及实验条件所能做到的。（二）、提高的程度１、以中国药典２００５年版一部为基准。２、中国药典２００５年版一部，成方制剂和单味制剂共收载５６4个品种，其中有３２５个项目采用了高效液相色谱法进行定量分析，占５７.6 ％。（三）、高效液相色谱分析方法建立的一般步骤：　　一种高效液相色谱分析方法的建立，是由多种因素来决定的，除了了解样品的性质及实验室具备的条件外，对液相色谱分离理论的理解，对前人从事过的相近工作的借鉴以及分析工作者自身的实践经验，都对分析方法的建立起着重要的影响。通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相分析方法必须解决以下问题：（四）、高效液相色谱图存在问题、原因及解决方法　　液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。峰拖尾峰分叉保留时间波动四、结束语  安全和有效是评价药物的关键，也是药物生物活性的具体体现。如何保证药物的安全有效是中药现代化必须解决的首要问题。中药质量控制指标只有与其实际利用的功效密切相关，即有效性的控制指标是其效应指标，质量控制才能真正起到控制和评价药材质量的作用，否则作用就不大甚至没有作用。 原因1 、保护柱或分析柱污染2 、样品溶剂不溶于流动相解决方法1 、取下保护柱再进行分析。改变样品溶剂。原因色谱柱没有平衡流动相组分变化温控不当解决方法在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱防止变化（蒸发、反应等）调好柱温保留时间波动原因1 、柱温波动。2 、流动相不均匀。3 、流通池被污染或有气体4 、检测器出口阻塞5 、流动相配比不当或流速变化解决方法1 、控制好柱子和流动相的温度2 、使用HPLC 级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。3 、流通池被污染或有气体4 、取出阻塞物或更换管子。5 、更改配比或流速。基线漂移6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时。1 、柱温波动。7 、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成8 、样品中有强保留的物质。6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20 倍体积的新流动相对柱子进行冲洗1、控制好柱子和流动相的温度7 、检查流动相的组成。8 、使用保护柱基线漂移* * 2、与药典同名异物广东是“川、广、云、贵地道药材”的主产地之一，“南药”是广东的特产。有些特产药材已收入《中国药典》如陈皮、广藿香、广金钱草、广防己、广枣、砂仁、巴戟天、沉香、地龙、化橘红、何首乌、佛手、丁公藤……等。但尚有大部分广东常用中药材未被《中国药典》收载，有的其习用名称却与《药典》收载的名称相同，为同名异物的中药材. 3、已有的质量标准偏低。 《广东省中药材标准》收载119 个品种，建立了定量测定方法的有13 个，其中高效液相色谱法5个。（一）、HPLC 在部标中药成方制剂的应用《中华人民共和国卫生部药品标准》“中药成方制剂”分20 册，共4052 种，建立量化指标项目的占11% ，其中采用高效液相色谱分析方法的有４２项，占１.１２％，见表1。416 56 29 30 18 42 125 98 18 项目合计浸出物其他薄层扫描法气相色谱法液相色谱法分光光度法容量法、重量法挥发油测定含测方法表２近3版版药典品含量测定方法分析45.2 518 47 45 1146 2005 10.6 105 11 60 992 2000 1.2 11 3 17 920 1995 比例（%）高效液相色谱法气相色谱法薄层扫描法总收载数年份（一）、指导思想１、　在制定中药标准中突出中医理论的指导作用，反映中医用药与质量标准的内在关系。２、　在检测成分上也要注意以中医临床功能主治与现代药理学相结合进行研究。３、如所测成分含量低，应制定浸出物或增加一味药的含量测定。表3  多指标测定品种与项目大黄素、虎杖苷虎杖11 总黄酮、异鼠李素沙棘10 库拉素芦荟、好望角芦荟芦荟9 羟基红花黄色素、山奈素红花8 挥发油、桂皮醛肉桂7 总黄酮、野黄芩苷半枝莲6 甘草酸、甘草苷甘草5 丹参酮II A 、丹酚酸B 丹参4 马钱子碱、士的宁马钱子3 总黄酮、金丝桃苷山楂叶2 羟基红花黄色素、山奈素西红花1 检测成分品名序号正丁醇提取物、黄芩中黄芩苷鼻窦炎口服液24 含氮量、胆酸、栀子中栀子苷、黄芩中黄芩苷清开灵注射液23 黄芩中黄芩苷、总氮量清开灵口服液22 总黄酮、正丁醇提取物、木犀草素独一味胶囊21 金银花中绿原酸、黄芩中黄芩苷、连翘中连翘苷注射用双黄连20 牡丹皮中的丹皮酚、山茱萸中马钱苷六味地黄颗粒19 牡丹皮中的丹皮酚、山茱萸中马钱苷六味地黄丸18 白扬素、高良姜素蜂胶17 总黄酮、无水芦丁槐花16 羟基萘醌总色素、- ’- 二甲基丙酰阿卡宁紫草15 总黄酮、淫羊藿苷淫羊藿14 总黄酮醇苷、萜类内酯银杏13 绿原酸、木犀草素金银花12 表4  规定的含量限度为多成分之和≥0.24 HPLC 升麻甙和5-O- 甲基维斯阿米醇苷的总量防风12 ≥1.6 HPLC 粉防己碱、防己诺林防己11 ≥1.5 HPLC 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的总量大黄10 ≥2.0 HPLC 人参皂苷Rg1 、Re 、Rb1 的总量西洋参9 ≥10.0 西红花苷-I 、西红花苷-II 西红花8 ≥0.02 HPLC 槲皮素、山奈素瓦松7 ≥0.15 HPLC 齐墩果酸、常春藤皂苷元木通6 ≥1.8 HPLC 木香烃内酯、去氢木香烃内酯木香5 ≥5.0 HPLC 人参皂苷Rg1 、Rb1 和三七皂苷R1 的总量三七4 ≥21.0 HPLC 儿茶素和表儿茶素的总量儿茶3 ≥2.25 HPLC 人参皂苷Rg1 、Re 的总量人参叶2 ≥0.30 ；0.2 HPLC 人参皂苷Rg1 和Re 、的总量；Rb1 人参1 含量限度（%）测定方法检测成分品名序号≥6.0 HPLC 华蟾蜍次素和脂蟾毒配基的总量蟾酥25 ≥0.80 HPLC 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量穿心莲24 ≥0.80 HPLC 重楼皂苷I、重楼皂苷II 重楼23 ≥0.16 HPLC 麝香草酚、香荆芥酚香薷22 ≥0.20 HPLC 咖啡酸、咖啡酸乙酯牵牛子21 ≥0.20 HPLC 厚朴酚与和厚朴酚的总量厚朴花20 ≥2.0 HPLC 厚朴酚与和厚朴酚的总量厚朴19 ≥9.0 HPLC 胡黄连苷-I 、胡黄连苷-II 胡黄连18 ≥0.10 HPLC 槲皮素、山奈素金钱草17 ≥1.2 HPLC 苦参碱、氧化苦参碱苦参16 ≥0.7 HPLC 补骨酯素、异补骨酯素补骨酯15 ≥0.15 HPLC 吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总量吴茱萸14 ≥0.25 ；0.20 HPLC 人参皂苷Rg1 和Re 、的总量；Rb1 红参13 ３、在３２５个分析项目中测定芍药苷的有４５项，占１３.８％，测定黄芩苷的４３项，占１３.２％，测定盐酸小檗碱的１８项，占５.５％，测定大黄素的２０项，占６.２％。乙腈-0.01mol/L 庚烷磺酸钠溶液与0.02mol/ 磷酸二氢钾等量混合,用磷酸调节pH 至2.8 ）（21 ：79 ）；260 nm 马钱子马钱子碱士的宁乙腈-三乙胺醋酸溶液（1000ml 水中加冰醋酸30ml ，三三乙胺8ml ）（18 ：82 ）；289 nm 夏天无原阿片碱乙腈-三乙胺-冰醋酸-水（27 ：1.8 ：0.78 ：70.6 ）；270 荷叶荷叶碱乙腈-0.07mol/L 磷酸钠溶液（含0.0175mol/L 十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH 至6.0 ）（50 ：100 ）；216 nm 洋金花氢溴酸东莨菪碱乙腈-0.1% 磷酸溶液（三乙胺调pH8.0 ）；220 苦参苦参碱乙腈-0.02mol/L 磷酸二氢钾溶液（含0.2% 三乙胺）磷酸调pH 至2.7 （4：10 ）；210nm 麻黄盐酸麻黄碱乙腈-0.033mol/L 磷酸二氢钾溶液（35 ：65 ）；424nm 黄连、黄柏盐酸小檗碱生物碱乙腈-0.1% 磷酸溶液（13 ：87 ）乙腈-水（17 ：83 ）；230nm 白芍、赤勺芍药苷测定条件所属药材被测成分类别甲醇－0.4% 磷酸溶液（50 ：50 ）；350nm 　　独一味木犀草素甲醇-0.4% 磷酸（50 ：50 ）；360nm 银杏槲皮素山奈素异鼠李素甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.5% 冰醋酸（1：1：19.4 ：78.6 ）；363nm 山楂叶金丝桃苷甲醇-水-冰醋酸（45 ：54 ：1）；257nm 槐花芦丁乙腈-0.05% 磷酸（26 ：74 ）；270nm 淫洋藿淫洋藿苷甲醇-醋酸-水（42 ：4：54 ）；283 陈皮、青皮橙皮苷甲醇-冰醋酸-水（30 ：4：60 ）；283nm 化橘红柚皮苷乙腈-0.1% 磷酸溶液（11 ：89 ）；250nm 葛根葛根素甲醇-水-磷酸（47 ：53 ：0.2 ）；280nm 黄芩黄芩苷黄酮类乙腈-0.4% 磷酸溶液（13 ：87 ）；327nm 金银花绿原酸乙腈-水（15 ：85 ）；240nm 山茱萸马钱苷甲醇-乙腈-甲酸-水（30 ：10 ：1：59 ）；286nm 丹参丹酚酸B 甲醇-水（75 ：25 ）；270nm 丹参丹参酮IIA 甲醇-0.1% 磷酸溶液（85 ：15 ）；254nm 大黄大黄素、大黄酚蒽醌类乙腈-水（32 ：68 ）；蒸发光散射检测器黄芪黄芪甲苷乙腈A；水B，梯度洗脱；203nm 人参、三七人参皂苷类甲醇-0.2mol/L 醋酸铵溶液-冰醋酸（67 ：33 ：1）；250nm 甘草甘草酸（单铵盐）皂苷类（1）根据所测成分的性质，制定其分析纯化的方法。（2）根据被分析样品的特性，选择适用于样品分析的高效液相色谱分析方法。（3）由获得的色谱图进行定性或定量分析。原因1 、流动相PH 选择不当2 、干扰峰3 、样品与填料表面残留硅羟基发生反应解决方法调整PH 值。a 、使用更长的色谱柱。b 、改变流动相或更换色谱柱。a 、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b 、更换色谱柱峰前延原因1 、样品过载2 、样品溶剂选择不恰当3 、柱温低解决方法降低样品含量。a 、使用流动相作为样品溶剂。升高柱温