生化检验技术基础与进展上海长征医院实验诊断科于嘉屏一、比色分析1．比色分析理论――Beer-Lambert 定律A = lg （I0/I ）＝KCL 或I ＝I0×10-KCL I0 ：入射光强度I ：透过光强度K ：常数C ：溶液浓度L ：溶液的厚度（1）郎伯定律I0 It l L -dI∝Idl ，-dI ＝aIdl ，dI/I=-adl 积分It L dI/I ＝-a dl 得：ln(I0 / It) ＝-aL I0 0 将ln 改为lg ，则为：lg （I0 / It ）＝-0.434aL ＝K’L 令lg （I0 / It ）＝A，则A＝K’L （2）比尔定律A ＝K”C （3）郎伯-比尔定律A ＝KLC 透光率（transmittance ，T，透射率）T ＝I / I0 吸光度（absorbance ，A）光密度（eptical density ，D或OD ）A ＝lg I0/I ＝-lgT T ＝10-A ＝10-KCL A ＝KCL 当L用cm ，C用mol/L 表示，则K即称之为摩尔吸光系数，用ε表示。当C＝1mol/L ，L＝1cm ，则ε＝A。T％与A的关系－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－透光率（T）吸光度（A）－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－1 0.000 0.75 0.125 0.5 0.301 0.25 0.602 0.17 0.770 0.1 1.000 0.05 1.301 0.01 2.000 0.001 3.000 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－2．影响因素（1）化学因素的影响溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。（2）非单色光的影响比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。波长的选择（3）光学因素的影响散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光线通过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时，导致吸收值的偏差。（4）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度L增大而影响测量值。3．比色法的误差 （1）仪器误差滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，仪器结构，散热不良。（2）方法误差（3）操作误差比色法举例1. 总蛋白(TP) 蛋白质中的肽键+Cu 2+ 碱性条件紫红色络合物引起在波长540~560nm 范围内吸光度的上升, 与总蛋白含量成正比2. 白蛋白(ALB) 白蛋白+溴甲酚绿pH4.2 白蛋白溴甲酚绿复合物引起在波长630nm 范围内吸光度的上升, 与白蛋白含量成正比二、分光光度计1．光源热光源: 钨灯、卤钨灯（320 ～2500nm ）气体放电光源：氢灯、氘灯（185 ～375nm ）。氘灯发光强度比氢灯强3～5倍，是目前紫外光区常用光源。2. 单色器单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。(1) 棱镜玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适用于350 ～3000nm 的波长范围。石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-4000nm 间分光。但由于石英棱镜折射率低于玻璃，因而色散能力差。(2) 光栅光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。3．比色杯比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻璃适用于350nm 以上光区，而石英杯则适用于紫外和可见光区。4．检测器在分光光度计中，把光信号转变成电信号输出的装置称检测器。光电池光电管光电倍增管双波长分光光度计来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为λ1 和λ2 的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差△A 。三、酶法分析酶法分析包括两方面的内容：①借助酶来测定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。②借助酶来测定另一种酶的活性，实际上是用酶来测定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。葡萄糖葡萄糖＋O2 ＋H2O 葡萄糖氧化酶葡萄糖酸＋H2O2 H2O2 ＋苯酚＋4- 氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺＋H2O 尿素尿素＋H2O 脲酶2NH4+ ＋CO2 NH4+ ＋α- 酮戊二酸＋NADH 谷氨酸脱氢酶谷氨酸＋NAD+ ＋H2O 肌酸激酶（CK ）磷酸肌酸＋ADP CK 肌酸＋ATP 葡萄糖＋ATP HK 葡萄糖-6- 磷酸＋ADP 葡萄糖-6- 磷酸＋NADP G6PDH 6- 磷酸葡萄糖酸＋NADPH ＋H+ 丙氨酸氨基转移酶（ALT ）丙氨酸＋α- 酮戊二酸ALT 丙酮酸＋谷氨酸丙酮酸＋NADH ＋H+ LDH 乳酸＋NAD+ ＋H2O 酶催化特点高度的特异性高催化效率作用条件温和酶的活性部位底物结合部位催化部位酶的辅助因子金属离子辅基和辅酶NAD ，NADP 酶的分类1. 氧化还原酶2. 转移酶3. 水解酶4. 裂合酶5. 异构酶6. 合成酶酶的系统命名应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。乳酸脱氢酶L- 乳酸：NAD+ 氧化还原酶肌酸激酶ATP ：肌酸磷酸转移酶酶的活性单位一国际单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量. IU→U U/L 1Katal 为每秒钟转化1mole 底物的酶量1国际单位=16.67 nKatal 1Katal=6×107 国际单位酶活性测定 影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH 、温度、酶浓度。在最适条件下以求达到最大的反应速度。但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。酶活性测定的最适条件合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度反应混合液的最适pH ，缓冲液种类和浓度去除各种抑制剂酶促反应的两个阶段反应级数0 级1 级[P] 1. 可逆反应2. 产物抑制3. 酶变性失活v=dP/dt 4. 底物不饱和[S] 时间t 酶反应进程和酶浓度曲线酶量[E] 40 1.[E] 越大，线性反产应期越短物2.[E] 相同，[S] 越小，[P] 20 线性反应期越短10 5 0 5 10 15 20 时间(min) 酶反应时间曲线时间(min) 5(t0) 反应时间越短，10(t1) 线性范围越大15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量[E] 米氏方程米氏曲线米氏常数米-孟氏公式：v＝Vm[S]/(Km ＋[S]) 当[S]<>Km 时，则v＝Vm ，即反应速度是一个常数，为零级反应。如[S] ～Km 时，混合级反应。米氏常数的意义 如v＝0.5Vm ，则Km ＝[S] ，Km 值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。Km 等于ES 的解离常数；而Km 的倒数可代表酶和底物的亲和力。Km 是酶的特征性常数，当pH 、温度和离子强度恒定时，Km 只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则Km 的变化不大。米氏常数的应用（1）如已知酶的Km ，可计算某一底物浓度时的v/Vm 。（2）如要求v占Vm 一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km 的多少倍。（3）利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算工具酶的用量。（4）测定几个同工酶对同一底物的Km ，可估计是原级（Km 常有差异）还是次生性同工酶（Km 接近或相同）。（5）测定正逆方向底物的Km ，可大体知道该酶催化哪一方向为主。（6）如已知一组酶中各酶的Km 及其相应底物的浓度，有助于寻找限速步骤。Km 的求取Lineweaver-Burk 作图法1/ v ＝(Km/Vm)(1/S) ＋1/Vm Eadie-Hofstee 作图法v ＝Vm －Km(v/S) Eisenthal 和Cornish-Bowden 作图法设Y轴和X 轴分别为求取Vm 及Km 的座标，将不同S浓度点在X轴的负侧；相应的反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在Y 轴上的座标为Vm ，在X 轴上的座标为Km 。酶活性测定的基本知识酶活性是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。（1）定时法测定酶反应开始后某一时间内（t1 到t2 ）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。产2 物3 生1 成t1 t2 （2）连续监测法连续测定（每15s ～1min 监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。这种方法的优点是可将多点的测定结果连接成线，很易找到成直线的区段，来计算酶活性。此法较为准确。分为直接连续监测法和间接连续监测法。法. 连续监测法的测定时间吸光度△A3 △A2 △A1 t1 t2 t3 t4 时间（3）平衡法通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把[P] 或[S] 的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。定时法与连续法比较定时法条件无限制试剂需量少，经济采用放射性试剂时，灵敏度高结果不能立刻揭晓人工操作多，费时毋需偶联酶产物会生抑制作用连续法因偶联酶使条件受限制需量较大与放射性试剂来比，灵敏度低结果立刻揭晓人工操作少偶联酶的费用很大偶联作用能消耗产物（一）工具酶及酶偶联反应 通过酶偶联反应间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活性。那些作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。A ＋B 酶1 C ＋D C （或D）＋E 酶2 F ＋G F （或G）＋H 酶3 I ＋J 酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示酶E 、H：辅助底物在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。如天冬氨酸转氨酶（AST ）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（MDH ），如污染0.03% 的AST ，则当AST 活性为7U/L 时，测定误差为6% 。而测定丙氨酸转氨酶（ALT ）的工具酶是乳酸脱氢酶（LDH ），如污染0.03% 的ALT ，则当ALT 活性为5U/L 时测定误差也是6% 。（二）常用监测物质的特性 1．NADH 或NADPH ：乳酸脱氢酶（LDH ）NAD+ 或NADP+ 苹果酸脱氢酶（MDH ）NAD+ 或NADP+ 谷氨酸脱氢酶（GLDH ）NAD+ 或NADP+ 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD ）动物G6PD NADP+ 微生物G6PD NAD+ NADH 或NADPH 在340nm 有特征性光吸收，而它们的氧化型NAD+ 或NADP+ 则没有这