Initiation of coagulation, new model. Amplification of coagulation Propagation of coagulation 实验室检查的方法与步骤一般先做过筛试验区别初期止血异常和凝血障碍。1 初期止血检查：①血小板计数。血小板数量明显减少时往往需做骨髓检查。②如血小板数量基本正常，应检查出血时间。血管异常和血小板疾病都可导致出血时间延长。③在怀疑有血小板功能异常时需使用多种诱导剂做血小板聚集试验。如血小板不聚集或聚集明显减低，则可能为血小板无力症。如聚集正常，需进一步观察瑞斯托霉素诱导的血小板凝聚。如该试验异常，应怀疑有血管性血友病的可能。实验室检查的方法与步骤2 凝血系统的过筛试验：①APTT 。血友病A与血友病B患者分别缺乏因子Ⅷ与因子Ⅸ，APTT 常明显延长。接触系统的缺陷也使APTT 延长，但一般无出血倾向。②PT 。因子Ⅶ缺乏的患者常有PT 延长。如果APTT 与PT 均有延长，提示有内、外途径和/或共同途径的多因子缺乏，或者有共同途径中某一因子缺乏。如PT 和/或APTT 异常可被等量的正常人血浆纠正，提示为某个（些）凝血因子缺乏；如不能被纠正，则可能有抗凝物质存在。③TT 。TT 延长见于纤维蛋白原减少、异常纤维蛋白原血症、纤维蛋白（原）降解产物的增加或抗凝物质的存在。实验室检查的方法与步骤出血过筛试验可大体估计止血障碍的部位和机理。但这些试验的敏感性与特异性较差，在有关因子减少至30% 以下时才有可能出现阳性反应。另一方面，出血过筛试验异常并不等于就是止血系统本身的疾病。在严重的肝功能损伤或口服抗凝药时，PT 和APTT 常有延长。在尿毒症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症以及服用非甾体抗炎药或其它某些药物时，也可发生出血时间延长与血小板聚集减低。实验室检查的方法与步骤在出血过筛试验异常并且临床上怀疑有出血性疾病时，应进一步选择更精确的实验检查以确定诊断。例如，测定血小板膜糖蛋白GPⅠb-Ⅸ与GPⅡb-Ⅲa 对巨大血小板综合症与血小板无力症有确诊的意义。血小板α颗粒与致密颗粒释放产物的测定有助于贮存池病的诊断。血栓烷与前列腺素测定是诊断先天性花生四烯酸代谢异常的必要条件。细胞内钙流的测定有助于判断血小板活化过程中信息传导的障碍。实验室检查的方法与步骤对怀疑有某个或某些凝血因子缺乏的病人应做有关因子定量与活性分析以明确诊断。例如，在PT 与APTT 延长怀疑有凝血共同途径异常时，可先测定血浆纤维蛋白原含量，如纤维蛋白原量正常再考虑因子Ⅴ、因子Ⅹ以及凝血酶原的测定。出血性疾病的基因诊断临床上实用的方法是进行基因多态性检测。主要的方法有限制性片断长度多态性（RFLPs ）与可变数目串联重复序列（VNTR ）分析。对因子Ⅷ基因内含子13 、22 多态性与内含子18 双态性的连锁分析可确定90% 血友病家系中的患者和携带者。von Willebrand 因子基因多态性位点也已发现了40 种。基因多态性分析不能直接诊断血友病或其它出血性疾病，但可检出携带者并可用于产前诊断和遗传咨询。出血性疾病的基因诊断近年来新出现的DNA 芯片技术结合了电子计算机与分子生物学的最新成果，可同时检测上万个DNA 片断。DNA 芯片将可能为遗传性出血性疾病的基因诊断带来革命性突破。病例I（HA ）男，14 岁，右膝关节出血。出血时间7分，凝血时间47 分。PT9.6 秒，TT12 秒，APTT118.7 秒。血小板聚集：ADP79.9% ，瑞斯托霉素79.1% S-TGT60 秒，加血清54.8 秒，加吸附血浆10.2 秒。因子VIII:C 1.8% 病例8（AVIII ）女，22 岁。在14 岁以后皮炎，右臂与右腿反复发生血肿。用激素治疗有效，已自行停药一月余。入院前4日又出现右腿肿胀疼痛。无家族史。凝血时间3小时。APTT98.5 秒，PT15 秒，TT13 秒。纤维蛋白原3g/L 。正常血浆与稀释至1/512 的患者血浆温育时凝固时间9分20 秒（对照3分18 秒）。因子Ⅷ活性为2.9% ，v WF:Ag125.7% 。补做的实验：①患者父亲的KPTT 和FⅧ:C 均正常；②患者抗FⅧ抗体滴度16 Bethesda 单位；③患者FⅧ:Ag<1% ，而其父为114% 。患者在用激素治疗并输注血浆、因子Ⅷ与丙种球蛋白后出血停止。病例2（vWD1 ）男，34 岁，龈血、鼻衄。出血时间14 分，凝血时间9.5 分。PT10 秒，TT11 秒，APTT57 秒，纤维蛋白原3.3 g/L 。血小板聚集：ADP65.3% ，瑞斯托霉素6.7% 。因子VIII:C 40% ，vWF 23% A 10-year-old girl had recurrent episodes of prolonged bleeding and hematoma starting in her early childhood, which could be stopped by transfusion of fresh frozen plasma or PCC. The coagulation tests revealed a markedly prolonged APTT (61.8-104 s) and TT (36-50.1 s), and a slightly prolonged PT (15.9-25 s). Fibrinogen, prothrombin and other coagulation factors as well as anticoagulant and fibrinolytic systems were all normal. Treatment of the patient’s plasma in vitro with either protamine or heparinase could completely normalize the coagulation abnormalities, but not with normal plasma. The anticoagulant activity of her plasma corresponded to 0.2 heparin U/mL, and concentration 0.22 heparin U/mL. In ex vivo study, the abnormal coagulation tests could effectively be corrected when the patient was intravenously administed with protamine. Alterations of DIC markers in two PS cases with giant hemangiomas Platelets APTT PT TT Fibrinogen AT D-dimer (×109/L) (s) (s) (s) (g/L) (%) (μg/L) Case 1 Before splenectomy 71 61.7 20.1 22.8 0.6 50 19.1 After splenectomy 110 37.2 14.4 18.2 2.91 83 3.22 Case 2 Before splenectomy 81 44.9 14.7 24.0 0.34 70.4 18.0 After splenectomy 138 40.1 14.5 18.2 3.06 98.6 1.95 Normal control 100-300 28-40 10.8-13.5 14.0-21.0 2.00-4.00 70-125 0.01-0.50 A scoring system for diagnozing Proteus syndrome Macrodactyly and/or hemihypertrophy 5 points Plantar or palmar cerebriform hyperplasia 4 points Lipomas/subcutaneous tumours 4 points Epidermal naevus 3 points Macrocephaly and/or skull exostosis 2.5 points miscellaneous other minor abnormalities 1 point A score of 13 or greater confirms its diagnosis. Our two patients scored 15.5 and 13 points, respectively, and met the criteria of Proteus syndrome diagnosis. 患者BSS ，女性，22 岁，自幼皮肤易出现瘀斑、鼻与牙龈出血。13 岁月经初潮后每次出血量大，持续达半月，可引起出血性贫血。患者父母非近亲婚配。父亲两年前死于恶性淋巴瘤。母亲与一兄弟无出血倾向。患者血小板计数为10×109/L ，血小板巨大，平均血小板体积为17 fl （正常范围为7-11 fl ）。最大血小板直径可达8μm 。出血时间>20 min （正常范围4-8 min ）。凝血检查正常。ADP 2μM 诱导的血小板聚集率为12.4% ，肾上腺素4.5M 诱导的血小板聚集率为10% ，但瑞斯托霉素12.5 mg/ml 不能引起血小板的聚集反应。图1 BSS 患者血小板的光学显微镜与电子显微镜图象左为患者外周血光学显微镜照片，显示血小板大小与红细胞相当；中为患者血小板电子显微镜照片（×10 000 倍），显示血小板巨大，颗粒增多；右为正常对照血小板电子显微镜照片（×10 000 倍）。A为BSS 患者，B为正常对照。括号内为阳性细胞百分数图2 流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白A B GPⅠ-Ⅸ(99.4%) GPⅡb (99.5% ）GPⅢa (94.9% ）阴性对照（2.5% ）阴性对照（2.5% ）GPⅠb (14.2%) GPⅠ-Ⅸ(21.7%) GPⅠb (99.2%) GPⅡb (98.8%) GPⅢa (97.9% ）1为正常对照；2 为BSS 患者。箭头示核苷酸突变部位。图3 糖蛋白Ⅸ基因DNA 测序1 2 Marker Control Mother Brother Patient 259bp 192bp 67bp The G to A transition in GP IX gene creates a unique site for restriction enzyme HpyCH4 III. 血小板糖蛋白IX 基因在CHO 细胞的表达突变型野生型血小板糖蛋白Ib 基因在CHO 细胞的表达突变型野生型Immunostaining analysis of GP Ⅰbαand GPⅨin the cytoplasm of cotransfected cells. (A) Untransfected CHO cells; (B) GPⅨin cells transfected with plasmids for GP Ⅰbα, GP Ⅰbβand wild-type GP Ⅸ; (C) GP Ⅸin cells transfected with plasmids for GPⅠbα, GPⅠbβand mutant GPⅨ; (D) GPⅠbαin cells transfected with plasmids for GPⅠbα, GPⅠbβand wild-type GPⅨ; (D) GPⅠbαin cells transfected with plasmids for GPⅠbα, GPⅠbβand mutant GPⅨ. Immunoblotting analysis of GPⅠbαand GPⅨin transfected CHO cells lysate. GPⅠbαand GPⅨare all detectable in the cells cotransfected with plasmids for GPⅠbα, GPⅠbβand wild-type or mutant GPⅨ. A number of GP Ib-IX comples gene mutations have been found. To date, only six mutations were described in GPⅨ, which are all located in the extracellular domain. Asp21 （GAC ）→Gly （GGC ）and Asn45 （AAC ）→Ser （AGC ）compound heterozygous missense Asn45 （AAC ）→Ser （AGC ）homozygous missense Trp126 （TGG ）→stop （TGA ）nonsense mutation Cys73 （TGG ）→Tyr （TAT ）homozygous missense Phe55 （TTT ）→Ser （TCT ）homozygous missense Cys 97 （TGT ）→Tyr （TAT ）homozygous missense HPLC elution pattern of plasma sterols in subjects with sitosterolemia. A, patient; B, heterozygote; C, control. Peak1, stigmasterol; Peak2, cholestanol; Peak3, sitosterol. DNA sequence surrounding nucleotide 18802 of ABCG5 exon 1. (A) DNA sequence of three affected patients. The C→T transition was present in the homozygous state. (B) DNA sequence of the patients’parents. The C→T transition was present in the heterozygous state. (C) DNA sequence of the normal control. ABCG5 基因外显子1中18802 位C→T 突变,导致22 位的谷氨基酸（Q）变为终止密码子。郁女，30 岁。2月前因妇科病查血发现血小板计数仅2 ×109/L ，多次
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