细菌内毒素检查2010.12 目录1、实验原理2 、实验试剂3 、试验器具4 、检查方法概述5 、供试品溶液的制备6 、内毒素限值的确定7 、最大有效稀释倍数（MVD ）的确定8 、鲎试剂灵敏度复核9 、干扰试验10 、供试品的细菌内毒素检查实验原理利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。阳性结果实验试剂鲎试剂从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml 。实验试剂细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。试验器具刻度吸管、凝集管（10×75mm ）、三角瓶、小试管（16×100mm ）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品）。检查方法概述凝胶法限量试验半定量试验光度测定法浊度法（终点浊度法和动态浊度法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法对干扰相对不敏感。较光度测定法不灵敏供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH 值在6.0 ～8.0 的范围内。可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。内毒素限值的确定一般按公式：L=K/M 式中L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml 、EU/mg 或EU/U （活性单位）表示。K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K=5EU/ （kg·h ），放射性药品注射剂K=2.5EU/ （kg·h ），鞘内用注射剂K=0.2EU/ （kg·h ）。M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。例：某产品M为14.3mg/kg ，L=5/14.3=0.35EU/mg 假如此产品的浓度为100mg/ml ，那么，L=0.35 100=35EU/ml 最大有效稀释倍数的确定最大有效稀释倍数（MVD ）指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。MVD=cL/λ式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml ，当L以EU/mg 或EU/U 表示时，c 的单位需为mg/ml 或U/ml 。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml ）。鲎试剂灵敏度复核目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。鲎试剂灵敏度复核2 、按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15 分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度）四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 秒钟。鲎试剂灵敏度复核细菌内毒素标准溶液的制备图示：鲎试剂灵敏度复核待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18 支，每支加入0.1ml 检查用水使溶解备用（规格大于0.1ml ／支的鲎试剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0.1ml/ 管分装到凝聚管中，至少准备18 管）。鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核计算当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。λc=lg-1 （ΣX/4 ）式中X 为反应终点浓度的对数值（lg ）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。鲎试剂灵敏度复核例子：结果判断当λc 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。干扰实验目的确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验。干扰实验进行干扰试验一般步骤供试品限值确定根据鲎试剂的灵敏度确定MVD 范围（供试品溶液浓度范围）预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度正式干扰试验干扰实验预实验目的初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg 或EU/U 活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml 表示），为正式干扰实验提供依据,避免干扰试验的盲目性。干扰实验操作方法1 、将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/λ0.03 （0.03EU/ml 为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。2 、使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。另取2支细菌内毒素检查用水作阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。例制备稀释倍数为4的供试品阳性对照溶液：www.book118.comλEU/ml 的内毒素标准液+0.3ml 稀释倍数为2的供试品稀释液＝0.6ml 含2λEU/ml 内毒素标准液的稀释倍数为4的供试品稀释液3 、保温60±2 分钟，观察并记录结果。干扰实验4 、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。5 、当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释倍数（不得超过MVD=CL/λ0.03 ），或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。6 、当供试品的内毒素限值单位为EU/mg 或EU/U 活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml 或活性单位/ml 表示。干扰实验举例某注射液限值为2.5EU/ml ，按MVD ＝CL/λ计算出灵敏度为0.03EU/ml 下的MVD 为83 倍，将供试品溶液进行一系列稀释，用灵敏度为0.25 EU/ml 的鲎试剂预实验，结果如下：干扰实验正式干扰实验制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。鲎试剂的准备取规格为0.1ml/λ支的鲎试剂36 支，备用。干扰实验加样准备好的36 支鲎试剂放在试管架上，按下图加样。干扰实验实验结果计算如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es ）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et ）。Es=lg-1 （ΣXs/4 ）Et=lg-1 （ΣXt/4 ）式中Xs 、Xt 分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg ）。干扰实验当Es 在0.5λ～2λ（包括0.λ和2λ）及Et 在0.5Es ～2Es （包括0.5Es 和2Es ）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et 不在0.5Es ～2Es （包括0.5Es 和2Es ）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如可将供试品进行更大倍数稀释（不超过MVD ）。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号的供试品。用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。供试品细菌内毒素检查在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。供试品溶液的制备根据内毒素限度值，计算MVD=CL/λ。然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD 。一般稀释至MVD ；如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的第二浓度作为日常检查浓度。阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液。供试品细菌内毒素检查供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。阴性对照即细菌内毒素检查用水。鲎试剂的准备取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂8支，每支加入0.1ml 检查用水使溶解备用。加样8 支管中2支加入0.ml 供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0.1ml 阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml 检查用水作为阴性对照管,2 支加入0.1ml 供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2 分钟。供试品细菌内毒素检查结果判断当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为均为阳性，应认为不符合规定；如2管中1管阳性，1管阴性，则另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD 而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将稀释至MVD 。供试品细菌内毒素检查例某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml ，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml 。MVD=CL/λ=0.5/0.125=4 将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。www.book118.com www.book118.com 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU) 表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对