第四章 药物定量分析与分析方法验证China Pharmaceutical University www.book118.com.cn  第四章药物定量分析与分析方法验证定量分析样品前处理方法定量分析方法特点药品质量标准分析方法验证一、定量分析样品前处理方法Pretreatment of sample used in quantitative analysis 定量分析样品前处理方法直接测定法－含金属或C-M 不牢固的有机金属经水解后测定法－卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）直接回流后测定 碱化回流后测定硫酸水解后测定经氧化还原后测定法－卤素联芳环牢固（一般用于测碘）碱性还原后测定法－如泛影酸酸性还原后测定法－如碘番酸利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量经有机破坏的分析方法湿法破坏HNO3-HClO4  HNO3-H2SO4  H2SO4-MSO4  金属以高价态存在干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度氧瓶燃烧法空心A. 燃烧瓶B. 铂丝网C.D. 盛固体样品滤纸及其折叠法www.book118.com. 称取液体样品方法氧瓶燃烧法样品吸收液测定方法含氟有机药物H2O pH4.3 HAc-NaAc Buffer 茜素氟蓝分光光度法含氯有机药物NaOH 溶液银量法汞量法分光法含溴有机药物H2O2-NaOH 液或NaOH 液-  银量法分光法硫酸肼饱和液含碘有机药物NaOH 液-  银量法碘量法硫酸肼饱和液汞量法分光法碘苯酯含量测定取本品约20mg ，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOH T.S. 2ml 与H2O 10ml 为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10 ml ，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml ，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min ，以除去剩余的溴蒸气，加KI 2g ，密塞，摇匀，用Na2S2O3 液(0.02mol/L) 滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml 的硫代硫酸钠液(0.02mol/L) 相当于1.388mg 的C19H29IO2 二、药品质量标准分析方法验证指导原则药品质量标准分析方法验证药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则微囊、微球与脂质体制剂指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则第三节药品质量标准分析方法验证目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标：评价分析方法的尺度效能指标包括: 精密度, 准确度, 检测限,定量限,选择性,  线性与范围,  耐用性(1) 准确度（accuracy ）：测量值与真实值接近的程度表示: 回收率测定方法：回收试验加样回收试验(2) 精密度（precision ）：定义: 同一样品多次测量值之间相互接近的程度表示：标准偏差(s),  相对标准偏差(RSD) 重复性:  同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:  同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性:  不同实验室，不同人测定的精密度(3) 专属性（specificity ）: 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性)。第三节药品质量标准分析方法验证 ------------ 性能指标(4) 检测限（limit of detection ，LOD ）：药物能被检出的最低浓度(μg/ml) 测定: 信噪比法(S:N=3:1) (5)  定量限（1imit of quantitation ，LOQ ）：药物能被定量测出的最低浓度(μg/ml) 测定: 信噪比法(S:N=10:1) 第三节药品质量标准分析方法验证 ------------ 性能指标(6) 线性与范围（linearity and range ）：待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围线性关系：Y=a+bx  （r=0.9999) 线性程度：相关系数(7) 耐用性（robustness ）:  测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH ，商品柱的品牌，柱温等检验项目和验证内容：第四节生物样品分析的基本步骤1. 药物从蛋白结合或缀合物中释出⑴蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4 、有机溶剂(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀⑵盐酸水解⑶酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.0~11.0 使肽键降解) 定量分析方法的验证 ---------- 生物样品分析（一）特异性	 内源性物质不得干扰原药、代谢物（二）标准曲线	r≥0.9900 ，至少5个浓度，不许外延（三）精密度和准确度	RSD≤15 ％、20 ％	 相对回收率85 ～115 ％（80 ～120 ％）（四）最低定量限LOQ 		3~5 倍t1/2 ，或1/10 ～1/20 倍Cmax （五）样品稳定性	 室温、冻融、冰冻长期（六）提取回收率（绝对回收率）	 一般低于100 ％，须稳定（七）质控样品	 已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度样品固相净化及反相高效液相色谱法测定血浆中茶碱血浆样品净化后空白血浆净化前空白血浆Column Zorbax C18 5μm 2.5cm  4.6mm 254nm Precolumn YWG-ODS 9-11μm 5  4.6mm Mobile Phase: 甲醇-醋酸钠(0.05mol/L pH3.0)50  50 中国药科大学药物分析教研室中国药科大学药物分析教研室1 2 3 定量分析样品前处理方法概述1 2 泛影酸碘番酸碘苯酯概述概述磺溴酞钠三氯叔丁醇酒石酸锑钾富马酸亚铁概述概述含金属有机药物卡巴胂金属有机药物不经有机破坏的分析方法: 7mm 50mm 30mm 尾部7mm 13mm 20mm 25mm 35  6mm 16  6mm 滤纸滤纸A G F E D C B 氧瓶燃烧装置及称样方法＋＋＋耐用性＋＋范围＋＋线性－＋定量限－＋－③检测限＋＋＋＋专属性②＋①＋①中间精密度＋＋重复性＋－精密度＋＋准确度限度定量含量测定及溶出量测定杂质测定鉴别　　　项目内容　　　①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充③视具体情况予以验证定量分析方法的验证 ---------- 生物样品分析伍朝筼等药学学报,1989,24(10):769~773 12 8 4 0min 茶碱咖啡因12 8 4 0min 12 8 4 0min 中国药科大学药物分析教研室