分离科学中的热力学分离科学中的热力学常规柱色谱的操作(1) 装柱：干法和湿法；(2) 上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可能窄；(3) 洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，可梯度洗脱；(4) 流分收集：常采用固定体积收集法，结合TLC 检验；(5) 样品回收：减压蒸馏或重结晶制备色谱技术干柱柱色谱干吸附剂，待分离样品配成浓溶液或吸附于少量填料上上样，洗脱液接近色谱柱底部时停止洗脱，挖出或切开色带。制备色谱技术时间短节省试剂玻璃柱尼龙柱减压柱色谱减压促进溶剂流动。制备色谱技术与加压相比，变换溶剂更加方便；吸附剂高度一般不超过5cm ；分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶剂的比例，开始阶段增加幅度较小(1%,2%,3%) ，随后幅度逐步增大(5%,10%,20% 等)，通常收集20-25 个流分即可将所有成分洗脱。制备色谱技术加压液相柱色谱技术(1) 快速色谱法：约0.2MPa ；(2) 低压液相色谱法：<0.5MPa ；(3) 中压液相色谱法：0.5 ～2MPa ；(4) 高压液相色谱法：>2MPa ；制备色谱技术加压液相色谱制备分离方法的建立：(1) 采用薄层色谱确定分离条件。对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选择分离条件。硅胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择Rf 不大于0.3 且具有较好分离效果的展开剂。制备色谱技术(2) 采用分析HPLC 来确定分离条件。对于中压和高压色谱则需要用分析HPLC 条件进行选择。优化条件时，寻求较小的容量因子(k’<3) 为原则，分离度需高于分析LC 所需要的水平，满足制备型LC 采用过载模式来提高效率。制备色谱技术进样量的影响实验室规模的制备，轻微过载，优点：(1) 便于回收高纯度目标成分，纯度>99% ；(2) 纯品几乎完全回收，回收率>95% ；(3) 分离程序简单，不需要为了得到纯品进一步分析所得到的组分。制备色谱技术过载：低浓度时，进样量增加使得容量因子改变超过10 ％浓度过载和体积过载制备色谱技术K不变，线性结果可预测K变化，非线性结果难预测边缘切割与循环色谱分离－－分离不佳时制备色谱技术密闭进样器是将流经检测器的柱流出液通过多通阀连至泵的入口；交替柱循环装置是连接两根色谱柱，通过阀门将第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根色谱柱上循环分离。中心切割制备色谱技术适当损失组分，但避免色谱峰两端微量组分的污染。制备加压色谱设备要求(1) 泵：流量大，压力不需要太大；(2) 进样器：大样品环六通阀，环管细而长而不是短而粗，样品溶液低浓度，大体积；(3) 色谱柱：装填均匀常采用柱床压缩技术即径向压缩和轴向压缩；(4) 检测器：不需要高灵敏；制备色谱技术快速色谱法简单易行制备色谱技术低压和中压色谱法第七章制备色谱技术制备HPLC 制备色谱技术更大大5-50 <1 进样量/mg 更低>10 25-50 >25 大制备柱低5-20 25-50 20-25 制备柱15000 5-10 25-50 8-10 半制备柱>50000 3.5, 5 25 4-5 分析型柱柱效填料粒径/ m 长度/cm 内径/mm 参数生产级的HPLC (1) 溶剂花费是最大成本，昂贵、毒性、难处理溶剂不使用；(2) 填料易得，性能好，重现性好；(3) 溶剂回收再用；(4) 直径大于5cm 的色谱柱需专门设计，保证床层稳定，避免高压破坏。制备色谱技术模拟移动床色谱(SMB) 通常的色谱存在下列问题：(1) 不能连续操作；(2) 溶剂和分离材料利用率低；(3) 流出组分被高度稀释；SMB 同样的分离材料，生产力增加60 倍，溶剂消耗量减少80 倍。制备色谱技术* * 制备色谱技术制备色谱的特点：最有效的制备性分离技术；实验室规模、小批量生产、产业化制备；不同领域产品量不一样，阐明化学结构和生物活性，30 －50mg 足够，分析用标准品100mg 以上，有机合成通常需要g级以上；薄层色谱柱色谱制备色谱技术制备薄层色谱法设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高；切割谱带更加方便；自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。制备色谱技术常规制备薄层色谱PTLC 薄层板制备为了增大上样量，增加了吸附剂用量。固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、C2 、C18 等反相健合硅胶支撑：玻璃板或铝箔平均25 m, 5~40 m 硅胶H、硅胶G、硅胶F254 、硅胶F365 、硅胶P 制备色谱技术硅胶粒径范围影响：越细越均匀，分离度越高，但？粒径范围宽，分离效率低，怎么办？------ 薄层厚度的渐变薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富集，可保持较窄的谱带。制备色谱技术薄层板的制作方法：常采用湿法：平铺法和涂铺法。混合平铺涂铺器自然干燥一夜105-120℃活化黏合剂硅胶煅石膏或羧甲基纤维素钠水溶液制备色谱技术薄层色谱条件选择操作参数流速展开模式分离距离样品量流动相选择性溶剂强度黏度展开缸类型薄层板和展开缸空腔体积比值温度蒸气相固定相薄层厚度颗粒大小质量开放型操作不连续常用溶剂(1) 电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2) 质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙醇等；(3) 强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4) 质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等；(5) 偶极作用溶剂：二氯甲烷(6) 惰性溶剂：环己烷、正己烷等。制备色谱技术制备色谱技术上样和展开先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶剂极性尽可能小。样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜，5-10% ；带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方2cm 处进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。？制备色谱技术样品检测有色物质直接观察斑点；荧光物质在紫外灯下观察；无色无荧光可在荧光板分离，紫外光下显示暗斑；喷显色剂，结构稳定且不易氧化物质可以用碘蒸气显色，可逆；制备色谱技术常用显色剂：硫酸：硫酸:乙醇(1:1) 溶液，喷后110℃烤5分钟，不同有机物显不同的颜色；0.05% 高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，背景淡红色；酸性重铬酸钾：5% 重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150℃烤薄层；5% 磷钼酸乙醇溶液：喷后120℃烤，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。制备色谱技术样品收集：切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器；回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1g 吸附剂用5mL 溶剂，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。4 型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用0.2-0.45 m滤膜过滤。硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可用Sephadex LH-20 过滤纯化。制备色谱技术常规制备TLC 速度慢，效率低，如何提高？加压离心加压制备OPLC 弹性气垫，外压使没有气相存在，展开剂强制流动，展开速度加快制备色谱技术更细的固定相颗粒、更长的薄层板离心制备CTLC 离心力加速流动相，分离速度快，操作简单，占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯度洗脱，进样量大，一次分离量0.1-0.2g. 制备色谱技术不同制备TLC 方法的比较制备色谱技术2-12 2-7 2-5 分离谱带数50-500 50-300 50-150 典型上样量/mg 在线在线离线组分分开方法环形线形线形分离模式12 18 18 分离长度/cm 1-4 0.5-2 0.5-2 薄层厚度/mm 离心加压毛细作用流动相迁移方法CTLC OPLC PTLC 参数常规柱色谱技术：可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，因此样品量可以更大；分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；不适合小颗粒的吸附剂？改进方法：减压、加压等制备色谱技术柱色谱常用固定相(1) 硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构体的分离选择性远大于其他色谱方法。烷基<卤素（F