第四章二维核磁共振谱4 ．1二维核磁共振的概述1．什么是二维谱二维核磁共振(2D NMR) 方法是有Jeener 于1971 年首先提出的,是一维谱衍生出来的新实验方法.引入二维后,减少了谱线的拥挤和重叠,提高了核之间相互关系的新信息.因而增加了结构信息,有利于复杂谱图的解析.特别是应用于复杂的天然产物和生物大分子的结构鉴定,2DNMR 是目前适用于研究溶液中生物大分子构象的唯一技术.一维谱的信号是一个频率的函数,记为S(ω), 共振峰分别在一条频率轴上.而二维谱是两个独立频率变量的信号函数,记为S(ω1,ω2), 共振峰分布在由两个频率轴组成的平面上.2D-NMR 的b最大特点是将化学位移,偶合常数等参数字二维平面上展开,于是在一般一维谱中重叠在一个频率轴上的信号,被分散到两个独立的频率轴构成的二维平面上., 同时检测出共振核之间的相互作用. 2。二维谱实验A. 原则上二维谱可以用概念上不同的三种实验获得,( 如图4.1),(1). 频率域实验(frequency- frequency) (2). 混合时域(frequency-time) 实验(3). 时域(time-time) 实验.它是获得二维谱的主要方法,以两个独立的时间变量进行一系列实验,得到S(t1,t2), 经过两次傅立叶变换得到二维谱S(ω1,ω2). 通常所指的2D-NMR 均是时间域二维实验二维谱实验中，为确定所需的两个独立的时间变量，要用特种技术－时间分割。即把整个时间按其物理意义分割成四个区间。（如图所示）（1）预备期：预备期在时间轴上通常是一个较长的时期，使核自旋体系回复对平衡状态，在预备期末加一个或多个射频脉冲，以产生所需要的单量子或多量子相干。（2）发展期：在t1 开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发，此时间系控制磁化强度运动，并根据各种不同的化学环境的不同进动频率对它们的横向磁化矢量作出标识。（3）混合期：在此期间通过相干或极化的传递，建立检测条件。4 ）检测期：在此期间检测作为t2 函数的各种横向矢量的FID 的变化以及它的初始相及幅度受到t1 函数的调制。与t2 轴对应的ω2 （ν轴），通常是频率轴，与t1 轴对应的ω1 是什么，取决于在发展是何种过程。相干(ccherence): 是描述自旋体系状态的波函数之间关系的一种物理量。，它通常没有简单的模型，它是横向磁化及相位的量。（不仅包括⊿m=1, 而且包括⊿m=0, ⊿m=2 状态之间关系)它可以通过射频脉冲的作用传递。C . 实验过程：用固定时间增量⊿t1 依次递增t1 进行系列实验，反复叠加，因t2 时间检测的信号S(t2) 的振幅或相位受到s(t1) 的调制，则接收的信号不仅与t2 有关，还与t1 有关，每改变一个t1 ，记录S(t2), 因此得到分别以时间变量t1,t2 为行列排列数据矩阵，即在检测期获得一组FID 信号，组成二维时间信号S(t1,t2) 。因t1,t2 是两个独立时间变量，可以分别对它们进行傅立叶变换，一次对t2, 一次对t1, 两次傅立叶变换的结果，可以得到两个频率变量函数S(ω1,ω2) 。如图3．二维谱的表达方式（1）堆积图(stacked plot). 堆积图的优点是直观,具有立体感.缺点是难以确定吸收峰的频率。大峰后面可能隐藏小峰，而且耗时较长。(2) 等高线（Contour plot ）等高线图类似于等高线地图，这种图的优点是容易获得频率定量数据，作图快。缺点是低强度的峰可能漏画。目前化学位移相关谱广泛采用等高线。4．二维谱峰的命名（1）交叉峰（cross peak ）:出现在ω1≠ω2 处，（即非对角线上）。从峰的位置关系可以判断哪些峰之间有偶合关系，从而得到哪些核之间有偶合关系，交叉峰是二维谱中最有用的部分。（2）对角峰（Auto peak ）:位于对角线（ω1 ＝ω2 ）上的峰，称为对角峰。对角峰在F1 和F2 轴的投影。5．二维谱的分类二维谱可分为三类：1 ）J 分辨谱（J resolved spectroscopy ）J 分辨谱亦称J谱或者δ－J谱。它把化学位移和自旋偶合的作用分辨开来，包括异核和同核J谱。2 ）化学位移相关谱(chemical shift correlation spectroscopy) 化学位移相关谱也称δ－δ谱，是二维谱的核心，通常所指的二维谱就是化学位移相关谱。包括同核化学位移相关谱，异核化学位移相关谱，NOESY 和化学交换。3 ）多量子谱（multiple quantum spectroscopy ）用脉冲序列可以检测出多量子跃迁，得到多量子二维谱。4．2 化学位移相关谱（Correlated Spectroscopy ,COSY ）二维化学位移相关谱包括同核化学位移相关谱（Homonuclear correlation ）1 ）通过化学键：COSY, TOCSY, 2D-INADEQUATE 。2 ）通过空间：NOESY, ROESY 。异核化学位移相关谱（Heteronuclear correlation ）强调大的偶合常数：1H-13C –COSY 强调小的偶合常数，压制大的偶合常数：COLOC( 远程1H-13C –COSY) www.book118.com 同核化学位移相关谱一。COSY(Correlated spectroscopy) 所谓的COSY 系指同一自旋体系里质子之间的偶合相关。1H-1H-COSY 可以1H-1H 之间通过成键作用的相关信息，类似于一维谱同核去偶，可提供全部1H-1H 之间的关联。因此1H-1H-COSY 是归属谱线，推导结构及确定结构的有力工具。1。COSY －90 。的基本脉冲序列包括两个基本脉冲在此脉冲作用下，根据发展期t1 的不同，自旋体系的各个不同的跃迁之间产生磁化传递，通过同核偶合建立同种核共振频率间连接图。此图的二个轴都是1H 的δ在ω1 ＝ω2 的对角线上可以找出一维1H 谱相对应谱峰信号。通过交叉峰分别作垂线及水平线与对角线相交，即可以找到相应偶合的氢核。因此从一张同核位移相关谱可找出所有偶合体系，即等于一整套双照射实验的谱图。2。COSY-45 。基本脉冲：90 。－t1-45 。-ACQ. 在COSY-90 的基础上，将第二脉冲改变成45 。许多的天然产物的直接连接跃迁谱峰在对角线附近，导致谱线相互重叠，不易解析。采用COSY-45 。由于大大限制了多重峰内间接跃迁，重点反映多重峰间的直接跃迁，减少了平行跃迁间的磁化转移强度，即消除了对角线附近的交叉峰，使对角线附近清晰。3. 相敏COSY 谱(DQF-COSY) COSY 谱，由于谱线信号色散分量作用，相邻的峰容易相互部分重叠，交叉峰的精细结构看不清楚，不便读出偶合常数。相敏COSY (phase sensitive-COSY) 谱的相位很复杂，相位调节的质量直接影响偶合常数的检测即信号灵敏度。在COSY 谱中对角线与交叉峰相位总是相差90 。。相敏COSY 谱中，磁化转移地结果产生一对交叉峰相位相差180 。以AX 体系为例。其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散型。谱图黄色圆圈为正峰，红色为负峰。谱图正负峰以不同的颜色表示（下图蓝色圆圈为正峰，红色为负峰）。也可以用实心表示正峰，空心表示负峰。其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散型从相敏COSY 可以直接读出J值。这里需要辨认主动偶合和被动偶合。所谓的主动偶合就是相关交叉峰直接的偶合。其余为被动偶合。主动偶合的每一对峰总是一正一负。被动偶合的交叉峰是相位相同（同为正或同为负）与COSY 有关的实验自旋回波COSY(SECSY), 双量子相干谱（DQC-COSY ）,同核接力相干谱（RCT ）.有兴趣的同学，可以阅读有关的书籍。二.天然丰度的双量子13C 谱INDEQUATE (13C-13C-COSY) 但是由于13C 天然丰度仅仅为1.1% ，出现13C-13C 偶合的几率为0。01 ％，13C-13C 偶合引起的卫线通常离13C 强峰只有20Hz 左右，其强度又仅仅是13C 强峰的1/200 ，这种弱峰往往出现在强13C 峰的腋部，加上旋转边带，质子去偶不完全，微量杂质的影响等因素，使1JC-C 测试非常困难。利用双量子跃迁的相位特性可以压住强线，突出卫线求出JC-C, 并根据Jc-c 确定其相邻的碳。一个碳原子最多可以有四个碳与之相连，利用双量子跃迁二维技术测量偶合碳的双量子跃迁的频率。13C-13C 同核偶合构成二核体系（AX,AB ）两个偶合的13C 核能产生双量子跃迁，孤立的碳则不能。它只有一个双量子跃迁，其频率正比于两个偶合的13C 核的化学位移之和的平均值。所以如果两个碳具有相同的双量子跃迁频率，即可以判断，它们是相邻。在INADEQUATE 谱图中F1 与F2 分别代表双量子跃迁频率和13C 的卫线，依次代表双量子和单量子跃迁频率。谱图中一个轴是13C 的化学位移，一个为双量子跃迁频率，其频率正比于两个偶合的13C 核的化学位移之和的平均值。因此谱图中F1=2F2 的斜线两侧对称分布着两个相连的13C 原子信号，表示碳偶合对的单量子平均频率与双量子频率间的关系，水平连线表明一对偶合碳具有相同的双量子跃迁频率，可以判断它们是直接相连的碳。依此类推可以找出化合物中所有13C 原子连接顺序。四。TOCSY HOHAHA 是通过交叉极化产生Hartmann-Hahn 能量转移，从而观察较低旋磁比核一种方法。它是通过增加混合时间，使一个质子的磁化矢量将重新分布到同一偶合网络的所有质子，得到多次的接力信息。由于增加混合时间，灵敏度降低，为了解决这一问题，采用高分辨相敏方法，，交叉峰和对角峰都是吸收型，特别适用于具有独立自旋体系的大分子，可进一步判断证实COSY 中因信号严重重叠而造成的不确定结果。选择适当的参数可通过一次实验得到独立自旋体系所有质子相关信息。2d-HOHAHA 的特点是：通过改变t1 测定，将同核Hartmann-Hahn 跃迁信号沿化学位移二维展开，并用一个脉冲序列测得多重接力COSY 。在复杂偶合体系1H 信号归属于解析中，而且在肽类，核苷，蛋白质等发挥巨大的作用。ROESY(CAMELSPIN) 若采用一个弱自旋锁场，则在旋转坐标体系中产生交叉驰豫NOE, 得到ROESY 谱（Rotating NOE), 即旋转坐标系中的NOE 增强谱。又称之CAMELSPIN 谱。它类似于NOESY ，能提供空间距离相近的核的相关信息。它的基本序列与TOCSY 相似，但采用低功率自旋锁场，可由连续波照射或一系列小脉冲角脉冲组成混合脉冲。基本序列：π/2-t1-(CW)X-ACQ ROESY 与NOESY 区别：NOESY 在分子量大和小的分子体系中，灵敏度很高。小分子的快速运动，产生NOE, 大分子的或降温产生负NOE. 而中等分子（300 ～1500 ）或特殊形状分子，在NOESY 中得不到交叉峰。而ROESY 交叉峰与分子量的大小无关。由于ROESY 是低的功率实验，可以检测到小的相互作用。4.3 异核化学位移相关谱-Heteronuclear Correlation of chemical shift 所谓异核化学位移相关谱是两个不同核的频率通过标量偶合建立起来的相关谱.应用最广泛的是1H-13C COSY. 1.1H-13C COSY. 常规的1H-13C COSY 是指直接相连的C-H 之间的偶合相关（1JCH ）。基本脉冲：1H-13C-COSY 谱图中F2 为13C 化学位移，F1 为1H 化学位移，没有对角峰，其交叉峰表明C-H 偶